【正文】 Primary strainQualitative strainQuantitative strain醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2023 n 視頻材料168。strainstrains GMP certification is asking, and the Chinese Pharmacopoeia 2023 edition of Pharmacopoeia also had a strain of the passages (from the original strain from freezedried powder) should not exceed 5 on behalf of The clearly defined.Enrichment United States Pharmacopoeia (USP) provides that: to microbial inoculation to a fresh medium on / in each germination time is referred to as a generation, and provides that strains of the passages (from the original strain from freezedried powder) must not exceed 5 generation. “ 我國的 GMP認證中也如此要求，并且中國藥典 2023年版藥典也已做出 “ 菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過 5代 ” 這個明確的規(guī)定。 NBRC(IFO)168。 CMI168。 DSMZ168。 ATCC168。 林業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ CFCC），中國林業(yè)科學院 抗菌素菌種保藏管理中心（ CACC），中國醫(yī)科院醫(yī)用生物技術研究所168。 工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ CICC），中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院168。中國科學院微生物研究所168。922023版中國藥典 《 藥品微生物實驗室規(guī)范指導原則 》醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2023 國內認可的菌種收藏機構n 1979年 7月，全國第一屆菌種保藏管理會議正式成立中國菌種保藏管理委員會（ CCCCM），委員會下設 7個全國性菌種保藏管理中心及機構所在地：168。醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2023 不同保藏方法的比較醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2023 六、質控微生物醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2023 保藏菌株要求168。n 保藏 將預凍后的冷凍管轉移至液氮氣相 (150℃ )或液相 (196℃ )。醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2023 液氮超低溫凍結法n 指懸浮于保護劑中的菌種經程控降溫后，移置于－ 196℃的液氮或－ 150℃ 左右的液氮氣相中保存的一種長期菌種保藏方法。醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2023 80℃℃ 冰箱凍結法冰箱凍結法n 將菌種懸浮于保護劑中，在－ 80℃ 冰箱中凍結保存的一種長期菌種保藏方法。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2023 真空度檢測 用高頻電火花檢查各安瓿管的真空情況，如管內呈現(xiàn)灰藍光，說明真空度符合要求。l 終止干燥時間應根據(jù)下列情況判斷 ：l 安瓿管內凍干物呈酥塊狀或松散片狀l 真空度接近空載時的最高值l 樣品溫度與管外溫度接近l 選用 1～ 2支對照管，其水份與菌懸液同量，當其水分完全蒸發(fā)時視為干燥完結醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2023 預凍n 制備菌懸液、經分裝到進行預凍之間的時間不宜超過 1h；n 分裝完成后將安瓿管立刻放入－ 35～－ 40℃ 冰箱預凍 1h，使菌液完全凍結；n 可采用分段式預凍，先將分裝好的安瓿管置－ 20℃ 凍 30分鐘，再放入－ 80℃ 冰箱凍 30min；n 采用離心式凍干裝置時勿需預凍。n 用長毛細滴管將菌懸液分裝到安瓿管內， ～ ，操作時要把帶有菌懸液的長毛細滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。l 121 ℃ ， 30min.醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2023 保護劑的準備n 保護劑： 12%脫脂牛奶蒸餾水溶液， 2～ 5ml/管；n 滅菌鍋加熱至沸騰，將牛奶管放入鍋中， 113℃ 滅菌20min；n 打開放氣閥緩慢排出蒸汽， 取出滅菌后脫脂牛奶試管，迅速放入涼水中冷卻；n 30℃ 培養(yǎng) 2天，無菌檢查合格后備用。l 噴碼于安瓿管外， 160℃ 固定 20min。醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2023 安瓿管的準備l 清洗l 選用中性玻璃材質的安瓿管；l 2%鹽酸浸泡 8～ 10h，自來水沖洗至中性，蒸餾水沖洗 2～ 3次；l 置于烘箱中烘干 。n 菌種易退化、污染。保藏時間 1 ～ 2年。4～ 6 ℃ ，干燥處；216。216。滅菌： — 121 ℃ 濕熱滅菌 30min，蒸發(fā)水分； — 160 ℃ 干熱滅菌 2h；216。醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2023 v 操作步驟：液體石蠟預處理斜面培養(yǎng)物制備灌 注 石 蠟保 藏216。 保藏 3~6個月v 培養(yǎng)和保藏醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2023 定期移植法n 操作簡單，使用方便；n 對設備和人員要求不高；n 可隨時使用，便于觀察菌種；n 工作勞動強度大，屬短期保藏，保藏成本高；n 菌種傳代頻繁，易退化、污染。 絲狀真菌 26 ℃ ， 5~7dn 保藏168。 細菌 37 ℃ ， 12d168。五、微生物保藏醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2023 常用菌種保藏方法n 定期移植法n 液體石蠟法n 真空冷凍干燥法n 80℃ 低溫凍結法n 液氮超低溫凍結法醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2023 定期移植法n 亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)，完成培養(yǎng)于 4～6℃ 進行保存并間隔一定時間（ 36個月）進行移植培養(yǎng)的一種短期菌種保藏方法。168。 五、微生物保藏醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2023 n 微生物菌種保藏方法168。 n 菌種保藏管理 要求各保藏中心必須具有保藏菌種的詳細歷史及有關實驗 資料 。n 結合形態(tài)學、碳源利用情況和 ITS rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析等多相鑒定的結果 , 將 CMCC(F)98003鑒定為黑曲霉 （ Aspergillus niger ）。distance.CMCC(F)98003與黑曲霉 A. niger 序列同源性為 100%。Bar,areaboveOnlybootstrapbranchesNumbers值大于 50%數(shù)值 ,基于 β微管蛋白基因序列的黑色組曲霉的 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig Neighbourjoining tree based on βtubulin sequence data of Aspergillus section Nigri注 :四、微生物鑒定 鑒定實例 2醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2023 nβ微管蛋白基因序列 分析圖 CMCC(F)98003與黑色組的其他種序列同源性 也具有很高的相似性 ,16888聚類在分類距離最近的一個分支上 ,geicindicated.50%valuesvalues.areabove圖例為遺傳距離 .Note:基于 ITS區(qū) rDNA序列的黑色組曲霉的 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig A Neighbor Joining Tree of Aspergillus section Nigri. based on Their ITS DNA Sequences注 :140 166 17 173四、微生物鑒定 鑒定實例 2醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2023 n ITS rDNA區(qū)序列 分析圖 positiondefinedisandofsequencetheCThe 2:βtubulin gene PCR amplification result.表 ITS序列特殊位點堿基差異Table Difference of base position in ITS sequence堿基位點Base position140