【正文】 (2) 遺傳病相關(guān)基因的檢測(cè)：鐮刀型細(xì)胞貧血、血友病。 (2) 基因表達(dá)：用 RTPCR檢測(cè)某一特定基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。 3’ 339。 Tm = + (%G + C) PCR產(chǎn)物的檢測(cè) ? 瓊脂糖凝膠電泳； （ EB） ? 分子雜交； ? 限制性內(nèi)切酶酶切分析； ? 微孔板夾心雜交法； ? 直接測(cè)序 反轉(zhuǎn)錄 PCR (RTPCR) RTPCR 將以 RNA 為模板的 cDNA 合成同 PCR 結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。 ? 引物 5`末端 堿基無(wú)嚴(yán)格限制 ， 只要與模板 DNA結(jié)合的引物長(zhǎng)度足夠 ， 末端 可以游離 。計(jì)算機(jī)分析 。 循環(huán)次數(shù)取決于模板 DNA的濃度 30次 — 擴(kuò)增 100萬(wàn)倍 引物設(shè)計(jì)原則 ? 引物 長(zhǎng)度 1530bp ? 引物 堿基 盡可能 隨機(jī)分布 ， 避免出現(xiàn)嘌呤 、 嘧啶堆積現(xiàn)象 ， 引物 G+C含量宜在 4555%左右 。 并具有 5`3`聚合酶活性及 3`5`外切酶活性 ， 因此可以校正 PCR反應(yīng)中某些單核甘酸的錯(cuò)配 。 PCR特異性 取決于人工合成的一對(duì)引物和模板 DNA結(jié)合的特異性 。 ? 大型垂直板電泳 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase Chain Reaction) 一 . PCR 的基本原理 根據(jù)細(xì)胞分裂中 DNA 半保留復(fù)制 機(jī)理在體外快速擴(kuò)增某一特定 DNA 片段的方法。 ? 在聚丙烯酰胺凝膠中加入了尿素作為變性劑，以確 保 DNA 片段保持單鏈狀態(tài)并以線狀 DNA分子的形 式泳動(dòng)。 RNA 瓊脂糖凝膠電泳 1． 10X MOPS 電泳緩沖液 200 mM MOPS [3(嗎啉代 )丙磺酸 ], pH 50 mM NaAc 10 mM EDTA, pH 使用前，將 10X MOPS 稀釋至 1X MOPS 2． 甲醛 瓊脂糖凝膠的制備 甲醛的終濃度： ％ 3． 電泳前 RNA 樣品的處理 用 甲醛和甲酰胺等 處理 RNA 樣品以 打開(kāi)的 RNA 發(fā) 夾結(jié)構(gòu) 4． 電泳結(jié)束后 用 EB 染色液染色。 ? 為防止外源性 RNase 的污染，所用的托盤、梳子、 倒膠槽、電泳槽等需要用焦碳酸二乙酯 (DEPC) 或 H2O2處理；所用的緩沖液要用 DEPC 處理的 ddH2O 來(lái)配制。 SYBR (綠色熒光染料 ) ? 安全性高； ? 敏感性是 EB 的 2 倍； ? 用于 DNA 和 RNA 的染色； ? 檢測(cè)方便 激發(fā)光波長(zhǎng)： 280 nm 和 502 nm 發(fā)射光波長(zhǎng)： 530 nm 可用紫外光透射儀、可見(jiàn)光透射儀或激光掃描儀檢測(cè) 。 (2) 電泳結(jié)束后將瓊脂糖凝膠浸入 EB 染色液中染色。 樣品緩沖液 NH2 C2 H5 H2N N+ Br 溴化乙錠 (Ethidium bromide, EB) EB/ 堿基 瓊脂糖凝膠中 DNA 的檢測(cè) EB 染色方法 EB 終濃度： ?g/ml (1) 將 EB 直接加入瓊脂糖凝膠中染色。 DNA 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠濃度與線狀 DNA 分子的有效分離范圍 瓊脂糖凝膠濃度 (%) 線狀 DNA 分子的有效分離范圍 (kb) 30 → 12 → 10 → 7 → 3 → 常用電泳緩沖液 緩沖液 工作液 儲(chǔ)存液 /LT A E 1 X 5 0 X4 0 mM T r is 乙酸 2 4 2 g T ri s1 mM EDT A 5 7 .1 ml 冰乙酸1 0 0 m l 0 . 5 M EDT A (p H )TBE 0 .5 X 1 0 X4 5 mM T r is 硼酸 1 0 8 g T ri s1 mM EDT A 5 5 g 硼酸4 0 ml 0 .5 M EDT A ( pH 8 .0 )TPE 1 X 1 0 X9 0 mM T r is 磷酸 1 0 8 g T ri s2 mM EDT A 1 5 .5 ml 磷酸4 0 ml 0 .5 M EDT A ( pH 8 .0 )6X 樣品緩沖液 ％ 溴酚藍(lán) ％ 二甲苯氰 FF 40％ 蔗糖 (1) 溴酚藍(lán)和二甲苯氰 FF 在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)，用來(lái)預(yù)測(cè) DNA 樣品的電泳情況。 DNA 或 RNA 電泳原理 ? 用 瓊脂糖凝膠電泳分離、鑒定和純化 DNA 分子 ? 用變性瓊脂糖凝膠電泳分離和鑒定 RNA 分子 ? 用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 DNA 測(cè)序反應(yīng)中 合成的系列單鏈 DNA 片段 (5500 bp) 核酸電泳類型 － ＋ ～ V ～ mA ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 遷移方向 電泳儀 樣品槽 負(fù)極 正極 電泳緩沖液 水平電泳槽 瓊脂糖凝膠槽 ? 瓊脂糖 (agarose) 是 D 和 L半乳糖殘基通過(guò) ?(1?3) 和 ?(1?4) 糖苷鍵交替構(gòu)成的線狀聚合物，瓊脂糖凝膠 可形成孔徑為 50 nm 到 200 nm 的分子篩。 ? DNA 或 RNA 分子量越大，遷移速率越慢，反之， 分子量越小，遷移速率快。 質(zhì)粒 DNA 濃度 = OD260 x 50 ?g/ml x 稀釋倍數(shù) 質(zhì)粒的鑒定 DNA/RNA 電泳 (DNA/RNA Electrophoresis) 電泳 (electrophoresis) 帶電荷物質(zhì)在電場(chǎng)中移 動(dòng)的現(xiàn)象叫電泳。Cl, pH 。 100 ?g/ml RNase A) 中 加溶液 II (200 mM NaOH。 ? 飽和期 (平臺(tái)期 ) 培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分和氧耗盡，培養(yǎng)基中的細(xì)菌代謝 產(chǎn)物達(dá)到抑制細(xì)菌快速生長(zhǎng)的濃度；細(xì)菌密度為 1 X 109 2 X 109 細(xì)胞 /ml LB 培養(yǎng)基 大腸桿菌的生長(zhǎng) 收獲細(xì)菌 將菌體懸浮在溶液 I (50 mM TrisCl, pH 。 倍體積的乙醇 1 倍體積的異丙醇 DNA 的純化與濃縮 常用的鹽溶液 鹽類 儲(chǔ)存液 (M) 終濃度 (M) 醋酸鈉 醋酸銨 氯化鋰 氯化鈉 注：需用 70％ 乙醇洗滌 DNA 沉淀以除去 DNA 中 的鹽離子。 TrisHCl 飽和酚：用 TrisHCl (pH ) 來(lái) 飽和酚 , 使 其 pH 值達(dá)到 ；否則呈酸性的酚將導(dǎo)致 DNA 分子 損傷斷裂。溶菌酶催化細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中 N乙酰葡糖胺與 N乙酰胞壁酸殘基之間 ?1， 4 連接的水解。 高分子量的染色體 DNA 難于復(fù)性而 與細(xì)胞碎片一起沉淀下來(lái)，而質(zhì)粒 DNA 存在于 上清中。 ? NaOH 使細(xì)菌的染色體 DNA 及質(zhì)粒 DNA 變性。 用 TRIzol 試劑處理細(xì)胞或勻漿組織 氯仿萃取蛋白質(zhì) 沉淀 RNA 洗滌 RNA 沉淀 用 RNasefree ddH2O 溶解 RNA， 并置 20?C保存 檢測(cè) RNA (加５ ?l RNA到１ % 瓊脂糖凝膠中 ) 總 RNA提取過(guò)程 rRNA 80% 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的總 RNA tRNA 和 snRNA 10% mRNA 13% M． RNA分子量標(biāo)準(zhǔn) (RNA ladder) 1, 2． 人肝細(xì)胞總 RNA 28S rRNA (5025 bp) 18S rRNA (1868 bp) 28S rRNA 條帶強(qiáng)度是 18S rRNA 條帶強(qiáng)度的 2 倍。 提取 RNA 時(shí)所用緩沖液及器皿的處理 用 TRIzol 試劑 (Invitrogen/GIBCO 公司 ) 提取總 RNA的方法 。 ? 用 % DEPC 浸泡 EP 管、 Tip 頭 1620 小時(shí)，然 后高壓滅菌除去 DEPC。 異硫氰酸胍法 提取總 RNA 焦碳二乙酯 (DEPC) 使 外源性 RNase 變性并 失活。 ? 異硫氰酸胍和十二烷基肌氨酸鈉為 強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)變 性劑 ，能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，使 總 RNA 從細(xì)胞中釋放出來(lái) 。高純度 DNA 的 OD260/OD 280 值大于 ； 50% 蛋白質(zhì) /50% DNA 混合物的 OD260/OD280 值大約為 。因 此，在制備基因組 DNA 過(guò)程中應(yīng)減少物理機(jī)械作用，如不要使 用旋渦振蕩儀等。盡量將組織切得小一些，便于蛋白酶 K 和 SDS 快速、有 效的作用于組織塊。 基因組 DNA的制備方法 (1) 防止內(nèi)源性 DNase 應(yīng)快速分離、剪切、勻降組織或快速洗滌培養(yǎng)細(xì)胞。 (3) 基因組 DNA 沉淀 用 倍體積的 3 M NaAC 和 倍體積的 100% 乙醇沉淀 DNA, 用 70% 乙醇除去 DNA 沉淀中的鹽離子。C條件下用裂解緩沖液 (100 mM NaCl； 10 mMTrisCl, pH ； 25 mM EDTA, pH ； % SDS； mg/ml 蛋白酶 K； 100 ?g/ml RNase A) 消化組織細(xì)胞 1618小時(shí)；消化培養(yǎng)細(xì)胞 23 小時(shí)。 從細(xì)菌或真菌中制備基因組 DNA 時(shí) ，首先用溶菌酶破壞 其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。 ? 鹽離子存在時(shí) 乙醇或異丙醇 沉淀基因組 DNA以 濃縮 DNA。 PCR是一種高效快速的 體外 DNA聚合 程序 四、經(jīng) PCR獲取目的 DNA PCR 體系 ? 模板 ? 引物 ? 耐熱 DNA聚合酶 ? dNTPs ? 含 Mg2+的緩沖液 PCR的過(guò)程 ? 變性 (Denaturing): 經(jīng)加熱使模板 DNA 從 dsDNA 變成 ssDNA ? 退火 (Annealing): 引物與模板 DNA雜交 ? 延伸 (Extension): DNA 合成 ing PCR的頭三個(gè)循環(huán) 基因組 DNA 的制備 (Preparation of genomic DNA) 從細(xì)胞或組織中提取的 基因組 DNA 可用于 : ? 建立基因組文庫(kù)； ? 克隆特定的基因； ? 用 Southern 印跡檢測(cè)某一基因的存在和拷貝數(shù)； ? 用 PCR 反應(yīng)檢測(cè)基因的存在和突變等； ? 進(jìn)行 RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 ) 分析 ? 蛋白酶 K 和 SDS 可 破壞細(xì)胞膜 及細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，使 基因組 DNA 從破碎的細(xì)胞中釋放出來(lái)。 第二步： 篩選 含有目的 cDNA的克隆。 第二步： 篩選含有目的基因 的克隆。 轉(zhuǎn)化率為 109 轉(zhuǎn)化子 /?g DNA。轉(zhuǎn)化率為 5 X 1062 X 107 轉(zhuǎn)化子 /?g DNA。所用的轉(zhuǎn)化方法不同，處理細(xì)胞使其進(jìn)入感受態(tài)的方法也不同。 感染 (Infection)： 利用病毒將外源 DNA 導(dǎo)入真核細(xì)胞的 過(guò)程。 轉(zhuǎn)染 (Transfection)： 將外源 DNA 導(dǎo)入 真核細(xì)胞 的過(guò)程。 核糖體 細(xì)胞核 RNA 目的蛋白