分離工程第六章ppt課件(參考版)
2024-09-22 18:20本頁(yè)面
【正文】 （ 1）細(xì)胞色素 C，溶菌酶，卵清蛋白，肌紅蛋白（陰離子交換柱）； （ 2）細(xì)胞色素 C，胃蛋白酶，脲酶，血紅蛋白（陽(yáng)離子交換柱） 在一種抽提液中含有三種蛋白質(zhì)，其性質(zhì)如下： 蛋白質(zhì) 相對(duì)分子量 等電點(diǎn) A 20220 B 21000 C 5000 試設(shè)計(jì)一個(gè)方案來(lái)分離純化這三種蛋白質(zhì)。 選擇題 進(jìn)行疏水吸附層析時(shí)，以下哪種條件比較合理（ ） （ A）在有機(jī)溶劑存在時(shí)上柱，低鹽溶液洗脫 （ B）在有機(jī)溶劑存在時(shí)上柱，高鹽溶液洗脫 （ C）低鹽條件下上柱，高鹽溶液洗脫 （ D）高鹽溶液上柱，按低鹽、水和有機(jī)溶劑順序洗脫 （ E）低鹽條件上柱，低鹽洗脫 回答題 用增加鹽離子強(qiáng)度的方法，從指定的離子交換柱上洗脫下列蛋白質(zhì)，指出它們被洗脫下來(lái)的先后順序，并說(shuō)明理由。 填空題 DEAE纖維素是一種 —— 交換劑，CM纖維素是一種 —— 交換劑。 ? 水中溶解度較差蛋白如球蛋白、膜結(jié)合蛋白低鹽濃度也能很強(qiáng)地吸附，用疏水作用層析也難將它們分離。 ? 缺點(diǎn) ? 由于疏水性相互作用機(jī)理比較復(fù)雜，吸附劑的選擇和洗脫分離條件不易掌握。 三、應(yīng)用及特點(diǎn) 應(yīng)用 ? HIC基于疏水性吸附分離純化蛋白質(zhì)類生物大分子，與 IEC的離子交換作用完全不同，可與 IEC互補(bǔ)短長(zhǎng)，分離純化利用IEC難于分離的蛋白質(zhì)。 Mechanism of HIC 疏水性配基與親水性固定相粒子之間的偶聯(lián)主要利用氨基的結(jié)合或醚鍵結(jié)合。可根據(jù)系列柱實(shí)驗(yàn)來(lái)判斷蛋白質(zhì)表面的疏水性質(zhì)。 因疏水性吸附作用與配基的疏水性（疏水鏈長(zhǎng)度）和配基密度成正比，故配基修飾密度應(yīng)根據(jù)配基的疏水性而異，一般為10~40?mol/cm3，過(guò)小則疏水性吸附作用不足，過(guò)大則洗脫困難。 二、疏水性吸附劑 各種凝膠過(guò)濾介質(zhì)經(jīng)偶聯(lián)疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑。 ? 原因：根據(jù)蛋白質(zhì)鹽析沉淀原理，在離子強(qiáng)度較高的鹽溶液中，疏水性相互作用增大。 ? 親水性蛋白質(zhì)表面均含有一定量的疏水性基團(tuán)，可與親水性固定相表面偶聯(lián)的短鏈烷基、苯基等弱疏水基發(fā)生疏水性相互作用，被固定相（疏水性吸附劑）所吸附。 （ 1） 細(xì)胞色素 C， 溶菌酶 ， 卵清蛋白 ， 肌紅蛋白 （ 陰離子交換柱 ） ； （ 2） 細(xì)胞色素 C， 胃蛋白酶 ， 脲酶 ， 血紅蛋白 （ 陽(yáng)離子交換柱 ） 。用增加鹽離子強(qiáng)度的方法，從指定的離子交換柱上洗脫下列蛋白質(zhì)，指出它們被洗脫下來(lái)的先后順序，并說(shuō)明理由。（ 5分） 例題 簡(jiǎn)述離子交換層析的分離原理 。陽(yáng)離子交換柱中，pHpI帶正電荷，帶正電荷多少的順序?yàn)椋汉颂呛怂崦?、胰島素、胃蛋白酶。（ 5分） 離子交換拄中， pH與 pI差值 大的物質(zhì)帶電荷多。 陽(yáng)離子交換柱。 例題 用 SephadexG100柱（排阻層析柱）及強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換柱（離子交換柱）來(lái)分離核糖核酸酶 ① （分子量 14000，pI ）胃蛋白酶 ② （分子量 36000，pI ）及胰島素 ③ （分子量 5700，pI ）指出以上物質(zhì)通過(guò)兩個(gè)柱洗脫順序，并簡(jiǎn)要說(shuō)明分離原理。 ? 思考題：為什么離子交換層析操作中很少采用恒定洗脫法？ IEC特點(diǎn) ? 優(yōu)點(diǎn) ?處理量大，具濃縮作用，可在較高流速下操作； ?應(yīng)用范圍廣泛，優(yōu)化操作條件可大幅度提高分離的選擇性，所需柱長(zhǎng)較短； ?產(chǎn)品回收率高； ?商品化的離子交換劑種類多，選擇余地大，價(jià)格也較低。 ?梯度洗脫的濃縮作用 ?IEC柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶后部的離子強(qiáng)度高于前部，因此后部的移動(dòng)速度高于前部，溶質(zhì)在洗脫過(guò)程中得到濃縮。 ?特點(diǎn) ?優(yōu)點(diǎn)：不需特殊的調(diào)配濃度梯度設(shè)備，操作簡(jiǎn)便； ?缺點(diǎn)：容易出現(xiàn)干擾峰；此外，容易出現(xiàn)多組分洗脫峰重疊的現(xiàn)象。 ?逐次洗脫法 ?流動(dòng)相離子強(qiáng)度階躍增大，溶質(zhì)的分配系數(shù)的降低和移動(dòng)速度的增大也是階段式的。通過(guò)改變流動(dòng)相離子強(qiáng)度的增大速度，可調(diào)整溶質(zhì)的洗脫體積，在改善分離度的同時(shí)縮短洗脫時(shí)間。 ??? mIAmB?若采用離子強(qiáng)度不變的流動(dòng)相進(jìn)行恒定洗脫，不同蛋白質(zhì)的洗脫體積相差很大，甚至分配系數(shù)大的蛋白質(zhì)很難洗脫，造成洗脫劑的大量消耗和洗脫時(shí)間的大幅度增加。 IEC操作（離子交換層
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