過氧化物酶(pod)同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳(參考版)
2024-08-29 17:05本頁面
【正文】 ，以免觸電。同時，清洗玻璃板不容許用強酸、強堿以及酒精溶液，一般用清水加一點洗滌劑進行清洗，然后用去離子水或蒸餾水潤洗。、膠皮、電泳槽。然后松開卡板，取出凝膠板,用解剖刀扁平部分插入玻板的一角(是分離膠的一角),輕輕撬去一塊玻板,用刀切掉分離膠右下角以示點樣順序,輕輕撬起分離膠,使之滾入染色培養(yǎng)皿中。點樣完畢后,連接好導線(正負電極不要接反,紅色為正極,黑色為負極),將電壓調至70 V,當溴酚藍標志線移至濃縮膠與分離膠分界處,將電壓調至150V,電泳23小時,當溴酚藍標志線剛好跑出膠板時,結束電泳。在濃縮膠聚合完畢后,小心取出梳子,兩拇指和食指捏住梳子的柄,其余三指頂住制膠框兩側,勻速地拔出梳子,然后向電泳槽中倒入預冷的電極緩沖液（原液要稀釋10倍）,緩沖液要沒過低板。取適量(2g)的馬鈴薯于研缽中,加1mL的PBS(磷酸緩沖液,),于冰上研磨至勻漿狀,在臺式離心機中以8000rpm離心5min，取上清,即為粗酶提取液,其中含有所需的POD。B、充分混勻的（分離膠或濃縮膠）溶液應盡快用移液槍延高板的一側慢慢加入膠板中C、膠制作完成后，松開卡板取下橡膠皮，然后再用卡板卡緊膠板。再靜置40min左右,濃縮膠聚合完全后為乳白色。再靜置40min左右,讓分離膠凝聚完全。四、實驗步驟：（教師演示，學生安裝）注意事項：在整個過程中要輕拿輕放，以免將玻璃板弄碎。試劑：電泳試劑貯存液配置見附表(附表1)。過氧化物酶能催化過氧化氫使聯(lián)苯胺氧化成藍色或棕色產(chǎn)物，據(jù)此即可將該酶在凝膠中顯色定位。本實驗采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術，分離、鑒定土豆、豆芽過氧化物酶同工酶。在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化，測定這種酶的活性或其同工酶，可以反映某一時期植物體內代謝的變化。過氧化物酶是植物體內普遍存在的、活性較高的一種酶。過氧化物酶同工酶電泳同工酶是指其催化的化學反應相同，而酶的結構、理化性質乃至免疫性質不同的一組酶。于是，此后的電泳過程中，酶蛋白在一個均一的電位梯度和pH條件下，僅按電荷效應和分子篩效應而被分離。當酶蛋白和慢離子都進入分離膠后，甘氨酸解離度劇增，遷移率迅速加大，從而趕上并超過所有酶蛋白分子。本來夾在快慢離子之間的酶蛋白區(qū)帶，在這個追趕中被逐漸地壓縮聚集成一條更為狹窄的區(qū)帶。因為電位梯度V、電流強度I和電導率S之間有如下關系：V＝I/S (4)所以在電流恒定條件下低電導區(qū)兩側就產(chǎn)生了較高的電位梯度。其遷移率介于快慢離子之間，被夾持分布于界面附近，逐漸形成一個區(qū)帶?！?％的甘氨酸（pI = ）遷移率最低，跑在最后邊，成為慢離子（尾隨離子）。待分離的酶蛋白樣品加在樣品槽中。② 在聚丙烯酰胺凝膠中，雖然濃縮膠和分離膠用的都是TrisHCl緩沖液，但上層濃縮膠為pH ，
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