【正文】 示差分光光度法對儀器的靈敏度和穩(wěn)定性要求較高，需用較高級的分光光度計，一般比色計不能測定。 (5)示差分光光度法：示差分光光度法是用一個與待測組分濃度相近的標準溶液作參比溶液與未知試樣溶液相比較測量其吸光度，再從測得的吸光度值，求出未知濃度。配制若干不同濃度的標準溶液，測定出一系列相應的吸光系數(shù)，用最小二乘法處理，求出系數(shù) a和 b，以求其最佳值，這樣得到的吸光系數(shù)比較可靠。在相同條件下，測量樣品溶液的吸光度，可以在標準曲線上查出相應的濃度。因此，配制一系列標準溶液、將測得的吸光度 A為縱坐標，標準溶液的濃度 C為橫坐標，可繪制出 A— C關系圖。 (2)吸光系數(shù)法：用標準品在最大吸收波長處的吸光系數(shù) ? 值為依據(jù)，進行定量測定。 2．測定方法 (1)標準對照法 ：在同樣條件下配制標準溶液及試樣溶液，在所選波長處分別測量吸光度，根據(jù)吸光度與濃度成正比的關系，用下式求出樣品濃度。 NCSSH3CH3C (三 )紫外光譜定量分析 農藥的有效成分在紫外區(qū) (200一 400nm)大多有特征吸收，一些吸收不明顯的農藥，也可以通過適當?shù)幕瘜W處理轉化成有吸收特征的物質，再加以分析。 具有鹵素、羧基、甲氧基等取代的酚類均有上述反應，五氯酚常用此法定量。如在堿性條件下，則形成亮紅色染料可在 490 nm處測定光密度。 甲萘威、克百威等經堿解后生成 α萘酚，與對硝基苯偶氮氟硼酸的甲醇溶液反應，呈黃色，在 590 nm處測光密度或加入對硝基氯化重氮苯在酸性條件下呈黃褐色。如馬拉硫磷、甲拌磷、乙硫磷、亞胺硫磷等均有此反應。二硫代磷酸酯形成 1∶ 1螯合物，一硫代形成1∶ 2螯合物。如對硫磷、甲基對硫磷、殺螟松均可用此法測定。此法可測定馬拉硫磷、樂果、倍硫磷等含硫或不含硫有機磷農藥。12MoO3]＋ 12H2O 如在鉬酸銨中加入 1氨基 — 2萘酚 — 4磺酸試劑或 SnCl2則顯藍色，在 735nm處測定光密度，所有有機磷農藥均可用此法測定全磷含量。 PO33－ ＋ 12MoO42－ ＋ 3NH4＋ ＋ 24H＋ → [(NH4)3 (5)濃硫酸與鉻變酸顯色反應； 鹵代苯氧乙酸類與濃硫酸反應產生甲醛，再與鉻變酸 (1， 8二羥萘、 3， 6二磺酸 )加熱到 150℃ 出現(xiàn)紫色。 6 6 6C H C l 1 2 4 2 4 6??? ????堿 硝 化乙 醇 鈉， ， 三 氯 苯 ， 二 硝 基 氯 － 間 苯 二 酚 (3)脫氯磺化顯色反應： DDT，甲氧 DDT等在 1％乙醇氫氧化鉀镕液中，脫掉一分子氯化氫，再與濃硫酸反應，即呈現(xiàn)顏色， DDT為桃紅色；甲氧 DDT為紫色。如對位 DDT、對位 DDD及三氯殺螨醇形成藍色 (598nm)；DDE， DDA形成紅色（ 420nm），鄰位 DDT形成紫色(590－ 511nm)。氯丹可以產生紫色 (404nm)，毒殺芬可產生黃色 (400 nm)，七氯、克菌丹、敵敵畏等都有此反應，反應過程中，含有水或乙醇對顏色形成有干擾?？稍?510 nm處測定光密度。 1． 含氯農藥的顏色反應 (1)吡啶 — 堿顯色反應 (Fujiwara反應 ) 含鹵素農藥在堿性溶液中，與吡啶短時間加熱，至少有兩個鹵原子和一個碳原子成鍵，產生紅色或藍色。五氯酚經氧化形成四氯代苯醌呈黃色。 農藥本身無色，經化學反應，引入或生成一個顯色基團而變成有顏色的化合物，此過程稱為“顯色” ，大多數(shù)農藥都需要顯色，才能進行測定。 農藥的可見光比色分析有以下幾種情況： 農藥有效成分本身帶有顏色，可以直接進行比色 ，這種農藥數(shù)量很少，如敵克松原藥為黃棕色，在波長435nm處有最大吸收峰。 隨著分光光度計的發(fā)展，比色測定已由分光光度計代替了舊時的比色計。 (二 )可見比色分析 可見比色分析法就是吸收光譜在可見光范圍內的分光光度法。如用示差分光光度法，誤差可以減少到千分之幾。在農藥分析上，配合薄層法凈化，可用于測定原藥及制劑中有效成分含量，也可劇定農藥殘留量及痕量農藥，其靈敏度和準確度可與近代儀器相比美。 去除雜質的方法有：加入掩蔽劑，選擇合適的顯色條件；選擇不受干擾的測定波長，利用空白溶液的抵消或通過薄板、柱層析、離子交換等方法，使被測組分與干擾雜質分離。 (4)反應溫度： 顯色反應一般在室溫下進行，但個別反應需要在特定的溫度下進行，因此，需要根據(jù)反應性質選擇合適的反應溫度。 (3)顯色時間： 顯色過程中由于顯色反應不同，需要的時間也不同，有時顏色不穩(wěn)定，放置時間過長就會變色或退色，影響測定結果。 (2)溶液的酸度： 顯色過程都是在一定的酸度條件下進行的，酸度高低對絡合物的形成，顏色的穩(wěn)定性，水解、沉淀等都有很大影響。 2． 顯色條件的選擇 顯色條件包括試劑的濃度、溶液的酸度、顯色時間、反應溫度、雜質的干擾等。 (三 )反 應 條 件 1． 顯色劑的選擇 在可見光區(qū)進行分光光度測定時，常需選擇合適的顯色劑將被測組分轉變?yōu)橛猩衔锘蚪j合物，然后進行測定。在儀器上將空白溶液的透光率調成 100％，以作為測量時的相對標準。 3． 吸光度與濃度之間關系的確定 在確定了分析條件之后，必須用一系列標準溶液制作一條標準曲線，標推曲線的濃度范圍應接近實際試樣的濃度，并在此濃度上下一定范圍包括待測樣品的濃度范圍，通過標準曲線的制作，可以了解遵循比爾定律的濃度范圍。狹縫也不是越小越好，狹縫太小，入射光強度變弱，也不利于測定。 2． 狹縫寬度的選擇 狹縫寬度直接影響測定靈敏度和校正曲線的線性范圍。因為在 λmax處，待測組分每單位濃度的吸光度值 變化最大 ，測量靈敏度較高，而且吸收曲線在最大波長附近較為平坦，可以較好的遵守比爾定律。也可以用水解、氧化還原或調節(jié)酸堿性方法等，消除干擾。 2．樣品的凈化 樣品中含有雜質，會直接影響分光光度法的測定結果，因此，測定前必須進行凈化。因此在紫外測定時，在溶解度允許的范圍內， 應盡量選擇極性小的溶劑 。 選擇溶劑應考慮的原則是：對試樣有良好的 溶解能力和選擇性 ；在測定波段內溶劑本身無明顯吸收；溶劑不得與被測組分發(fā)生化學反應；被測組分在溶劑中具有良好的吸收峰形。當苯環(huán)上引入生色基時，吸收峰顯著紅移，此時 E2帶就稱為 K帶。 E2帶在 203nm處有吸收， E2帶有些書籍也稱它為 K帶。二者可分別看成是苯環(huán)中的乙烯鍵和共軛乙烯鍵所引起的，也屬π→π* 躍遷。吸收峰在230一 270 nm之間， B帶的精細結構常用來識別芳香族化合物，但當苯環(huán)取代后或用極性溶劑時，精細結構消失。 C O (3)B吸收帶：這是芳香族化合物的特征吸收帶，由苯的π→π* 躍遷所產生。共軛雙鍵增加，波長紅移，而且吸收強度增加。該帶的特點是吸收強度很弱，處于長波方向，吸收峰波長一般在 270 nm以上?，F(xiàn)將吸收帶的種類與特點扼要總結如下： (1)R吸收帶：由 n→π* 躍遷產生的吸收帶，它具有雜原子和雙鍵的共軛基團?；衔锝Y構不同，躍遷類型不同、因而有不同的吸收帶。極性溶劑可使吡啶的 B帶吸收強度明顯增高，這可能是吡啶氮原子上的弧對電子與極性溶劑形成氫鍵的原故。一般有兩個吸收峰，在 200 nm附近有一個峰，屬 K帶，在 238nm附近還有一個峰，類似苯環(huán)的 B帶。 (5)雜芳環(huán)化合物 ①五元雜芳環(huán)化合物：如吡咯、呋喃、噻吩，可看作是環(huán)戊二烯的 C1被雜原子取代。菲的譜帶 E1為 25