【正文】 。 若必須做血清的熱滅活，請(qǐng)遵守 56℃ ， 30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。若在 37℃ 放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會(huì)因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。 解凍血清時(shí)，請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。推薦在－ 20℃ 儲(chǔ)存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。 6. 為什么儲(chǔ)存在冰箱中的胎牛血清會(huì)出現(xiàn)沉淀 ? GIBICO的胎牛血清 沒有預(yù)老化，儲(chǔ)存在 2－ 8℃ 時(shí)，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。經(jīng)此處理過的血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)只有微小的促進(jìn)，或完全沒有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng) ES細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。 4. 為什么要熱滅活血清 ? 加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以 400g稍微離心 ,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。 3. 血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理 ? 血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白 (形成凝血的蛋白之一 )在血清解凍后，也會(huì)存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。 2. 如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損 ? 建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于 2～ 8℃ 冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。然而，若存放于 4℃ 時(shí)，請(qǐng)勿超過一個(gè)月。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。 分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。 接種細(xì)胞起始濃度太低 細(xì)胞已老化 支原體污染 增加接種細(xì)胞起始濃度。培養(yǎng)液需在 2－ 8℃ 避光保存?；蛴每股爻? 補(bǔ)加谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子。 讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液。 比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染。 換入新鮮培養(yǎng)液 培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)減慢 由于更換不同培養(yǎng)液或血清。注意：大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能耐受滲透壓為 260 – 350 mOsm/kg。培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積。細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷。 培養(yǎng)細(xì)胞死亡 培養(yǎng)箱內(nèi)無 CO2。 用 DNase I 處理細(xì)胞。 分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。蛋白酶過度消化使得細(xì)胞裂解釋放 DNA。 懸浮細(xì)胞成簇 培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子。清潔支架和培養(yǎng)箱。 縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度。支原體污染。 或用抗生素除菌。 將培養(yǎng)液加熱到 37℃ ，搖動(dòng)使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液。冰凍保存培養(yǎng)液。 丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。 加 HEPES 緩沖液至 10 到 25mM 終濃度。（ 2）改用不依賴 CO2 培養(yǎng)液。細(xì)菌、酵母或真菌污染。 NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖力不足。 細(xì)胞分離試劑（ 1） 大部分連續(xù)細(xì)胞系，強(qiáng)貼壁細(xì)胞系，許多早代細(xì)胞 HBSS或無鈣鎂 PBS ％胰蛋白酶溶解在無鈣鎂平衡鹽溶液中 細(xì)胞表面蛋白完整性重要的連續(xù)細(xì)胞系 HBSS或無鈣鎂 PBS ％胰蛋白酶溶解在 EDTA 弱貼壁表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞（要求細(xì)胞表面完整性），原代細(xì)胞 HBSS或無鈣鎂 PBS EDTA,甘油 溶解在檸檬酸鈉中 強(qiáng)貼壁早代細(xì)胞系 HBSS或無鈣鎂 PBS ％胰蛋白酶溶解在 1mM EDTA， Dispase /ml 溶解在PBS 細(xì)胞分離試劑（ 2） 上皮細(xì)胞 1mM EDTA 1mM EDTA， Dispase /ml 溶解在 PBS 強(qiáng)貼壁細(xì)胞，上皮細(xì)胞，一些腫瘤細(xì)胞 1mM EDTA ％胰蛋白酶 1mM EDTA， Dispase /ml 溶解在無鈣鎂PBS 厚培養(yǎng)物，多層富含膠原的密集培養(yǎng) 1mM EDTA ％胰蛋白酶， 200單位 /ml膠原酶， 1mM EDTA溶解在無鈣鎂平衡鹽溶液中 培養(yǎng)液 pH 值變化太快 CO2 張力不對(duì)。 38 在溶解的一周內(nèi)使用貯存在 4℃ 冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對(duì)于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。 升級(jí)篇 細(xì)胞培養(yǎng) 8 35 當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的 50%。如果希望在 CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液。碳酸氫鈉需用高水平的 CO2平衡，以維持溶液的 PH值。 33 目錄上說， Hank‘s 平衡鹽溶液 (HBS)要在空氣中使用，不需要 CO2培養(yǎng)箱。 EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。 升級(jí)篇 細(xì)胞培養(yǎng) 7 32 培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？ 丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。 31 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？ 酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放 L谷氨酰胺供利用。 L谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。脫掉氨基后，L谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。總之，首選 MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、 RPMI1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開始，各種目的無血清培養(yǎng)最好首選 AIM V（ 12022）培養(yǎng)基（ SFM）。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊 升級(jí)篇 細(xì)胞培養(yǎng) 6 28 如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？ 培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。 C 太久。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后， 加以洗滌細(xì)胞和離心。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心， 應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。 24 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的 dish， flask是否均相同？ 不同廠牌的 dish 或 flask， 其所 coating 的 polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對(duì)大部分細(xì)胞沒有太大之影響， 惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish 或 flask 而有顯著之生長(zhǎng)差異。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。 C 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之 CO2 會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。 升級(jí)篇 細(xì)胞培養(yǎng) 5 23 為何培養(yǎng)基保存于 4 176。 21 偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)， 該如何處理？ 直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。 20 支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？ 支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。 19 支原體 (mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？ 不能。 18 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理？ 加入相應(yīng)抗生素。主要的污染原因?yàn)闊o菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。 升級(jí)篇 細(xì)胞培養(yǎng) 4 16 細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？ 冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial， 融合瘤細(xì)胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。 C 不可超過 1 小時(shí)， 以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入 80176。 C 以下， 再放入液氮槽 vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。 冷凍保存方法二 : 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降 13 176。 C30 分鐘 *) → 80 176。 15 冷凍保存細(xì)胞之方法？ 冷凍保存方法一 : 冷凍管置于 4 176。 C， 避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機(jī)會(huì)。注意：由于 DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能， 故不可將 DMSO 直接加入細(xì)胞液中， 必須使用前先行配制完成。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長(zhǎng)之一重要原因。 升級(jí)篇 細(xì)胞培養(yǎng) 3 11 欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？ 欲回收動(dòng)物細(xì)胞， 其離心速率一般為 300xg (約 1,000rpm)，5 10 分鐘， 過高之轉(zhuǎn)速， 將造成細(xì)胞死亡。 10 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？ 一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細(xì)胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時(shí)， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中， 保存于 –20 176。 8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？ 除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 含量為每公升 g 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用 10 % CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 為每公升 g 時(shí)， 則應(yīng)使用 5 % CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。 HS (horseserum) 則是指馬血清。 升級(jí)篇 細(xì)胞培養(yǎng) 2 5 何謂 FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清