【正文】 于血清結(jié)凍時體積會增加約 10 %， 必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。 2. 一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。 3. 瓶裝 (500ml) 血清解凍步驟 (逐步解凍法 ): 20℃ 或 –70℃至 4℃ 冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50 ml 無菌離心管可分裝 40～ 45 ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻 (小心勿造成氣泡 )，使溫度與成分均一，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由 –20℃ 直接至 37℃ 解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。 4. heatinactivation 是指 56℃ , 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份 (plement) 去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因?yàn)闀斐缮虻砦镏@著增多，且會影響血清之品質(zhì)。補(bǔ)體參與之反應(yīng)有： cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。 5. 勿將血清置于 37℃ 太久，若在 37℃ 放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。 6. 血清之沈淀物 . 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白 (lipoprotein) 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白 (fibrin) 造成，這些凝絮沈淀物不會影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沈淀物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因?yàn)闀枞^濾膜。 . 顯微鏡下觀察之 “ 小黑點(diǎn) ” ：通常經(jīng)過熱處理之血清，沈淀物的形成會顯著的增多。有些沈淀物在顯微鏡下觀察像是 “ 小黑點(diǎn) ” ，常會誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在 37℃ 中欲培養(yǎng)此 “ 微生物 “ ，但在 37℃環(huán)境下，又會使此沈淀物增多，更會誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。一般而言，此小黑點(diǎn)應(yīng)不會影響細(xì)胞之生長，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號的血清。 附 血清之生長測試 材料： MDCK cell (ATCC CCL34 或 CCRC 60004) aMEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12022022 ) 6well TC plate (or 35mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092013) 步驟： 1. 以 aMEM with 10 % FBS (已測試過 ) 培養(yǎng) MDCK 細(xì)胞于 T75 flask 至80% confluency。 2. 以 trypsinEDTA 處理細(xì)胞，離心后，加入適量不加血清之 aMEM 制成細(xì)胞懸浮液，并測細(xì)胞濃度。以不加血清之 aMEM 稀釋細(xì)胞濃度為 1 102活細(xì)胞數(shù) / ml。 3. 將 1 ml 細(xì)胞懸浮液接種入 6well plate 中，并另加入 1 ml 含不同濃度的血清 (20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , %) 之 aMEM，使血清最終濃度為 10% , 5 % , 2 % , 1 % , % , %。用已測試過之血清同時進(jìn)行對照組試驗(yàn)。 4. 37 oC， 5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 57 天，期間不需更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。 5. 去除培養(yǎng)基，加入 1 ml Carnoy’s 固定液 (甲醇 :冰醋酸 ﹦ 3:1)，室溫下靜置 10 min。 6. 去除固定液，水洗二次。 7. 加入 1 ml 10 % Giemsa solution，室溫下靜置染色 23 min。 8. 去除染液，水洗二次。 9. 以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù) 10. 計(jì)算 SPE ( Serum Plating Efficiency )： SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 % 11. 計(jì)算 RPE(Relative Plating Efficiency)： SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 % 比較各濃度血清培養(yǎng)基之 RPE，即可得知待測血清對細(xì)胞生長的影響。訂購多量同一批號的優(yōu)良血清，置于 –70℃ 保存之 基礎(chǔ)篇 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 1. 細(xì)胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為 1:3 至 1:6，依細(xì)胞種類而異。 2. 材料： . 無菌磷酸生理緩沖液 (Dulbecco’s phosphatebuffered saline, Ca++/Mg++ free, DPBS, GibcoBRL 21600010) . trypsinEDTA solution (% EDTA4Na, GibcoBRL 25300062)： 以 10 ml 分裝于 15 ml 無菌離心管中，保存于 –20℃ ，使用前放在 37℃ 水槽回溫。 . 新鮮培養(yǎng)基 . 無菌吸管 /離心管 /培養(yǎng)瓶 3. 步驟： . 附著型胞 (adherent cell) . 吸掉舊培養(yǎng)液。 . 用 DPBS 洗滌細(xì)胞一至二次。 . 加入 trypsinEDTA 溶液 (1ml/25cm2, 2ml/75cm2)， 37 ℃ 作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時，吸掉 trypsinEDTA 溶液。 (若不移去 trypsinEDTA，則在 trypsinEDTA 作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止 trypsin 作用，離心后再吸掉上清液。 ) . 輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。 . 懸浮型細(xì)胞 (suspension cell) . 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。 . 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。 . 融合瘤 (hybridoma) . 有些 hybridoma cell 需培養(yǎng)三天以上才會產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中。 基礎(chǔ)篇 細(xì)胞冷凍保存 （一） 1. 注意事項(xiàng)： . 欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好 (log phase) 且存活率高之狀態(tài)，約為 80 – 90 ％致密度。 . 冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如 hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。 . 注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。 DMSO 應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色 (以 micronFGLP Telflon 過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D2650)，以 5~10 ml 小體積分裝， 4℃ 避光保存，勿作多次解凍。 Glycerol 亦應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性。 . 冷凍保存之細(xì)胞濃度： . normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml . hybridoma: 1~3 x 106cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些hybridoma 會因冷凍濃度太高而在解凍 24 小時后死去。 . adherent tumor lines: 5~7 x 106，依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度，而 HeLa 只需 13 x 106cells/ml。 . other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 須至少 5 x 106cells/ml。 . 冷凍保護(hù)劑濃度為 5 或 10 ％ DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應(yīng)作一個 backup culture，以防止冷凍失敗。 . 冷凍方法： . 傳統(tǒng)方法 : 4℃ 10 分鐘 20℃ 30 分鐘 80℃ 16 18 小時 (或隔夜 ) 液氮槽 vapor phase 長期儲存。 . 程序降溫：利用等速降溫機(jī)以 –1 ～ 3℃ /分鐘之速度由室溫降至 –120℃ ，放在液氮槽 vapor phase 長期儲存。適用于懸浮型細(xì)胞與 hybridoma 之保存。 基礎(chǔ)篇 細(xì)胞冷凍保存 （二） 2. 材料： . 生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞 . 新鮮培養(yǎng)基