【正文】 細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題 基礎(chǔ)篇 無(wú)菌操作基本技術(shù) 1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái) (laminar flow) 以紫外燈照射 3060 分鐘滅菌，以 70 %ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面，并開(kāi)啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn) 10 分鐘后，才開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以 70 % ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無(wú)菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn) 10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。 2. 無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以 70 % ethanol 擦拭后才帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無(wú)菌區(qū)域，勿在邊緣之非無(wú)菌區(qū)域操作。 3. 小心取用無(wú)菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開(kāi)之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開(kāi)后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約 45176。 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。 4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來(lái)自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無(wú)菌操作臺(tái) (至少 Class II)。操作過(guò)程中，應(yīng)避免引起 aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如 DMSO 及 TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。 5. 定期檢測(cè)下列項(xiàng)目： . CO2 鋼瓶之 CO2 壓力 . CO2 培養(yǎng)箱之 CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染 (水盤的水用無(wú)菌水，每周更換 )。 . 無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)之 airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過(guò)濾膜，預(yù)濾網(wǎng) (300小時(shí) /預(yù)濾網(wǎng)， 3000 小時(shí) /HEPA)。 6. 水槽可添加消毒劑 (Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。 基礎(chǔ)篇 實(shí)驗(yàn)用品 1. 種類 ︰ . 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品均為無(wú)菌，除了玻璃容器與 pasteur pipet 外，其它均為塑料無(wú)菌制品。 . TC 級(jí)培養(yǎng)盤表面均有 coating 高分子物質(zhì)以讓細(xì)胞吸附，培養(yǎng)容器種類有 Tflask， plates, dishes, roller bottle 等，依實(shí)驗(yàn)需要使用。 . plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml . 塑料離心管 : 15 ml, 50 ml，均有 2 種不同材質(zhì)，其中 polypropylene (PP) 為不透明材質(zhì)， polystyrene (PS) 為透明材質(zhì)，可依實(shí)驗(yàn)需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。 . glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。 . 玻璃血清瓶 (Pyrex or Duran glassware)： 100 ml, 250 ml,500 ml,1000ml 2. 清洗 ︰ . 新購(gòu)玻璃血清瓶先以 ~ N HCl 浸泡數(shù)小時(shí)，洗凈后才開(kāi)始使用。 . 用過(guò)之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。 3. 滅菌 ︰ . 實(shí)驗(yàn)用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌 121℃ , 15 lb, 20 分鐘，置于 oven 中烘干。 . 實(shí)驗(yàn)用玻璃 pasteur pipet 以干熱滅菌 170℃ , 4 小時(shí)。 . 液體或是固體廢棄物可用 10 % hypochloride 溶液 (次氯酸，即漂白水 ) 或是蒸汽高壓滅菌 121 ℃ , 15 lb, 20 分鐘處理。 基礎(chǔ)篇 培養(yǎng)基 1. 液體培養(yǎng)基貯存于 4℃ 冰箱，避免光照，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前放在 37℃ 水槽中溫?zé)帷? 2. 液體培養(yǎng)基 (加血清 ) 存放期為六個(gè)月，期間 glutamine 可能會(huì)分解，若細(xì)胞生長(zhǎng)不佳，可以再添加適量glutamine。 3. 粉末培養(yǎng)基配制 (以 1 升為例 )： . 細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加 10 % 血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為 900 ml， pH 為 。 NaHCO3 為另外添加，若將 NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會(huì)造成 pH 之誤差，或局部過(guò)堿。因此粉末培養(yǎng)基及 NaHCO3 粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用 CO2 氣體調(diào)整 pH，而非用強(qiáng)酸 (HCl)或強(qiáng)堿 (NaOH)，因?yàn)槁入x子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可能有影響，且貯存時(shí)培養(yǎng)基的 pH 易發(fā)生改變。 . 材料： 純水 (milliQ 水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要 ) ，粉末培養(yǎng)基 ， NaHCO3 ，電磁攪拌器 無(wú)菌血清瓶 ， 或 mm無(wú)菌過(guò)濾膜 ， pH 計(jì)，真空泵， CO2 氣體 . 步驟： . 取粉末培養(yǎng)基溶于 700 ml milliQ 水中，攪拌使其溶解。 . 稱取適量之 NaHCO3 粉末溶于 200ml milliQ 水中，攪拌使其溶解，然后通入 CO2 氣體至飽和，約 35 分鐘。 . 將溶解且含飽和 CO2 之 NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合。混后溶液之 pH 應(yīng)為 ，除非 pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調(diào)整之。若為太堿，可再通入 CO2 氣體調(diào)整 pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過(guò)過(guò)濾膜時(shí)， pH 會(huì)升高 。 . 以 或 mm 無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾滅菌，同時(shí)分裝至無(wú)菌容器中，標(biāo)示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號(hào)等，貯存于 4℃ 。 (血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過(guò)濾 ) . 配制之培養(yǎng)基配制須作生長(zhǎng)試驗(yàn)與污染測(cè)試。 附 配制培養(yǎng)基之生長(zhǎng)測(cè)試 材料： MDCK cell (ATCC CCL34 或 CCRC 60004) 6well TC plate (or 35 mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092013) 步驟： 1. 以待測(cè)試培養(yǎng)基培養(yǎng) MDCK cell，接種 MDCK 細(xì)胞于 6well plate (或35mm TC dish) 中，每個(gè) well 接種 1 102 活細(xì)胞，同時(shí)作對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。 2. 接種 5～ 7 天后，在 100 倍倒立顯微鏡作觀察細(xì)胞群落之生長(zhǎng)，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時(shí)即可。 3. 去除培養(yǎng)基，加入 1 ml Carnoy’s 固定液 (甲醇：冰醋酸 ﹦ 3:1)，室溫下靜置 10 min。 4. 去除固定液，水洗二次。 5. 加入 1 ml 10 % Giemsa solution，室溫下靜置染色 23 min。 6. 去除染液，水洗二次。 7. 以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號(hào)的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不佳，則丟棄之。 基礎(chǔ)篇 抗生素 1. 細(xì)胞庫(kù)之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素 . 培養(yǎng)自 ATCC 引進(jìn)之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。 . 培養(yǎng)自其它實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)之細(xì)胞株，制作 token freeze 前培養(yǎng)基須添加抗生素，待 token freeze 通過(guò)污染測(cè)試后，大量培養(yǎng)時(shí)則不加抗生素。 2. 寄送活細(xì)胞時(shí)，須將培養(yǎng)液充滿整個(gè) flask 時(shí)，則須添加抗生素 (penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。 3. 若要檢測(cè) mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因 gentamicin 會(huì)抑制 mycoplasma 生長(zhǎng)。 4. 去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方 : penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin units/ml，注意混合使用后藥物毒性會(huì)增強(qiáng)。 5. 抗生素使用種類與濃度： 工作濃度 . 儲(chǔ)存溫度 . 殺滅細(xì)菌 penicillin 100 units/ml 20℃ G(+) bacteria streptomycin 100 ug/ml 20℃ G(+) and G() bacteria chlotetracycline 50 ug/ml 20℃ G(+) and G() bacteria gentamicin 50 ug/ml 20℃ G(+) and G() bacteria, mycoplasma amphotericin B ug/ml 20℃ yeast and molds nystatin 50 ug/ml 20℃ yeast and molds fungizone ℃ yeast and molds 基礎(chǔ)篇 血清 1. 血清必須貯存于 –20 ～ 70℃ ，若存放于 4℃ ，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。如果一次無(wú)法用完一 瓶，可將 40～ 45 ml 分裝于無(wú)菌 50 ml 離心管中，由