浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-基本技術(shù)(已修改)
2025-08-17 09:17 本頁面
【正文】 細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù) 培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞系的建立和鑒定 培養(yǎng)物的固定、染色 顯微鏡觀察 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞原代培養(yǎng) 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 細(xì)胞的運(yùn)輸 細(xì)胞的原代培養(yǎng) ? 是將機(jī)體內(nèi)的某組織取出，分散成單細(xì)胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長(zhǎng)繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細(xì)胞的分裂繁殖、細(xì)胞的接觸抑制、細(xì)胞的衰老、死亡等生命現(xiàn)象。 ? 幼稚狀態(tài)的組織和細(xì)胞，如動(dòng)物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進(jìn)行原代培養(yǎng) 意義 ? 原代培養(yǎng)的最大優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，具有二倍體的遺傳性，而且大多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出原來組織的特性。 ? 利用原代培養(yǎng)做各種實(shí)驗(yàn)（藥物測(cè)試、細(xì)胞分化及病毒學(xué)方面）效果很好。 ? 原代培養(yǎng)也是建立各種細(xì)胞系（株）必須經(jīng)過的階段。 ? 掌握無菌操作技術(shù) ? 了解小鼠解剖操作技術(shù) ? 了解原代細(xì)胞培養(yǎng)的一般方法與步驟 ? 了解培養(yǎng)細(xì)胞的消化分散 ? 了解倒置顯微鏡的使用 原代細(xì)胞培養(yǎng)的 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵? 實(shí)驗(yàn)材料 ? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ：孕鼠或新生小鼠 ? 液體 ：細(xì)胞生長(zhǎng)液（內(nèi)含 20%小牛血清） %胰蛋白酶 平衡鹽溶液 70%乙醇 ? 器材 ：滅菌鑷子、剪刀、滅菌培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng) 瓶、小瓶、燒杯、吸管、酒精燈 原代細(xì)胞培養(yǎng)方法 ? 胰酶消化法 ? 組織塊直接培養(yǎng)法 冷消化 溫消化 一次性消化 分次消化 消化法： 采用無菌操作的方法，把組織（或器官）從動(dòng)物體內(nèi)取出，經(jīng) 酶消化 處理，使分散成單個(gè)細(xì)胞，然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長(zhǎng)和繁殖。 貼塊法 消化法 原代培養(yǎng)方法分類 分次消化 消化法的分類 外植塊培養(yǎng)步驟圖解 操作步驟 1 取材 ? 用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。 ? 把整個(gè)孕鼠浸入盛有 75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺(tái)。 ? 用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。 ? 用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無菌的培養(yǎng)皿上。 ? 剔除胚胎周圍的包膜（若胚胎較大，應(yīng)剪去頭、爪），將胚胎放于無菌的含有平衡鹽溶液的培養(yǎng)皿中。 ? 漂洗胚胎，去掉平衡鹽溶液。繼續(xù)用平衡鹽溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。 操作步驟 2 切割 ? 將部分胚胎轉(zhuǎn)移至一個(gè)無菌小瓶中， 用 平衡鹽溶液 漂洗 。 ? 然后用眼科手術(shù)剪刀 小心地絞碎胚胎 ，直到成 1 mm3左右的小塊，再用 平衡鹽溶液 清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。 ? 靜置，使組織塊自然沉淀到管底，棄上清。 胰酶消化法操作步驟 消化、接種培養(yǎng) ? 視組織塊量加入 56倍的 %胰酶液 ， 37℃ 中消化 2040 min，每隔 5 min振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。 ? 加入 35 ml細(xì)胞生長(zhǎng)液 以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。 ? 靜置 510 min，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。 ? 1000 rpm，離心 510 min，棄上清液。 ? 加入 平衡鹽溶液 5 ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。 ? 加入 細(xì)胞生長(zhǎng)液 l2 ml（視細(xì)胞量），血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。 ? 將細(xì)胞調(diào)整到 5 105/ml左右，轉(zhuǎn)移至 25 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中， 37 ℃ 下培養(yǎng)。 胰酶消化法操作步驟 消化、接種培養(yǎng) 也可將此步驟簡(jiǎn)化為： ? 視組織塊量加入 56倍的 %胰酶液 ， 37℃ 中消化 2040 min，每隔 5 min振蕩一次。 ? 靜置，吸去上清，用 細(xì)胞生長(zhǎng)液 漂洗消化后的組織塊，用吸管反復(fù)吹打組織塊，使細(xì)胞分離，靜置，使未分散的組織塊下沉。 ? 取細(xì)胞懸液接種至加了 細(xì)胞生長(zhǎng)液 的培養(yǎng)瓶中（調(diào)整細(xì)胞濃度到 5 105/ml左右）， 37 ℃ 下培養(yǎng)。 （注意：省略了離心、計(jì)數(shù)等步驟） 組織塊直接培養(yǎng)法操作步驟 ? 組織塊接種： – 將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附于瓶底面。 – 翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將 細(xì)胞生長(zhǎng)液 加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。 – 37 ℃ 靜置 35 h，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入 細(xì)胞生長(zhǎng)液 中（勿使組織漂起）， 37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。 原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 ? 細(xì)胞接種后一般幾小時(shí)內(nèi)就能貼壁，并開始生長(zhǎng) ? 如接種的細(xì)胞密度適宜， 57 d即可形成單層 傳代細(xì)胞培養(yǎng) ? 細(xì)胞“一代”指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細(xì)胞世代或倍增不同。在一代中，細(xì)胞培增 36次 ? 培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，從容器中取出，以 1:2或 1:3以上的比率轉(zhuǎn)移到新的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為 傳代培養(yǎng) 。 ? 也是一種 將細(xì)胞種保存下去的方法 。同時(shí)也是 利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過程 。 ? 懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。 細(xì)胞傳代方法 根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有 3種。 1. 懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 ? 離心法傳代：離心（ 1000轉(zhuǎn) /分 ）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 ? 直接傳代法：懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶壁后，將上清培養(yǎng)液去除 1/22/3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。 2. 半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 （ HeLa細(xì)胞） ? 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。 3. 貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 ? 采用酶消化法傳代。常用消化液是 ％胰蛋白酶液。 消化法傳代培養(yǎng)步驟 ?選取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，在超凈工作臺(tái)的酒精燈 旁，倒去瓶中的舊培養(yǎng)液，加入 23 ml的 D Hanks液，輕輕振蕩漂洗細(xì)胞，以除去懸浮在細(xì)胞表面的碎片 (思考：還有什么作用？） ?加入適量 ％胰蛋白酶消化液，室溫消化，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞單層收縮突起出現(xiàn)空隙時(shí)，倒去酶液 ?用 Hanks液洗滌 1次，加入適量培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細(xì)胞，使其成細(xì)胞懸液。 ?以 1:2或 1:3進(jìn)行分裝，并在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo) 記，注明代號(hào)、日期，輕輕搖勻， 37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 ?觀察：細(xì)胞培養(yǎng) 24h后，即可觀察培養(yǎng)液的顏色及細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。 貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法 傳代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 ? 一般情況，傳代后的細(xì)胞在 2 h時(shí)左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上， 24 d就可在瓶?jī)?nèi)形成單層，需要再次進(jìn)行傳代 ?取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，在超凈工作臺(tái)用無菌吸管 把培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞吹打均勻。 ?轉(zhuǎn)移到無菌的離心管中，蓋緊膠蓋，平衡后離心 （ 1000 rpm/min） 5min。 (區(qū)別貼壁傳代 ) ?在超凈工作臺(tái)中吸
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