【正文】 按無菌操作各將其中一管棉塞打開，把棉塞放入滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，經(jīng)過一定時(shí)間再將棉塞塞好，連同對照一起放入培養(yǎng)室培養(yǎng)，溫度和時(shí)間同前。 然后一起放在30℃下培養(yǎng)48h后檢查有無菌落出現(xiàn)。用常規(guī)培養(yǎng)基如肉湯瓊脂，馬鈴薯葡萄糖瓊脂等，分別倒成平板，每種兩個，放入接種室或接種箱。 (1)平板法常用的檢查方法有平板法和斜面法兩種 ①檢查方法 接種室(箱)消毒滅菌效果的檢驗(yàn)如果培養(yǎng)基沒有什么變化，說明滅菌效果良好；如果某一位置的培養(yǎng)基出現(xiàn)了雜菌菌落，可能是擺放的太緊，導(dǎo)致蒸汽不暢，或鍋的結(jié)構(gòu)不合理等原因所致，應(yīng)根據(jù)上述情況進(jìn)行改進(jìn)；如果大部分或全部菌種瓶都出現(xiàn)雜菌，說明滅菌溫度或滅菌時(shí)間不夠，應(yīng)提高壓力或延長滅菌時(shí)間。 每采用一種新的培養(yǎng)基，或使用一種新的滅菌設(shè)備，以及變更滅菌的壓力和時(shí)間，都必須進(jìn)行滅菌效果的檢驗(yàn)。 培養(yǎng)基滅菌效果的檢查 消毒與滅菌的效果，直接影響菌種成品率的高低。 滴管滅菌前的包裝與移液管相同。塞好后用酒精燈火焰將露在管口外的棉花燒掉，然后用4cm～5cm寬的報(bào)紙條，以45度角螺旋形將每根移液管分別卷好，兩端不可外露，再根據(jù)需要將若干支扎成一束，即可滅菌。 試管也可若干支扎在一起，棉塞外再包一層報(bào)紙。 洗凈后烘干或晾干，然后按每5～7套用牛皮紙或報(bào)紙包好，也可裝在大飯盒或特制的盒內(nèi)，即可滅菌。 (1)培養(yǎng)皿玻璃器皿一般采用干熱滅菌，若用高壓蒸汽滅菌，滅菌后則要經(jīng)過干燥才能使用。 ②玻璃器皿的滅菌 洗滌時(shí)要分類進(jìn)行，以免浪費(fèi)洗滌藥劑和洗滌時(shí)間；對附有瓊脂培養(yǎng)基的器皿，應(yīng)先用水蒸煮融化后趁熱倒出，再用清水洗滌；對沾有蠟的器皿，應(yīng)先加熱使之融化后擦掉，再用清水沖洗干凈；對沾有焦油、樹脂的器皿，可用40%氫氧化鈉溶液洗滌。 (2)新的玻璃器皿因附有游離堿，不能直接使用，應(yīng)先在1%～2%的鹽酸溶液中浸泡10個h，再用清水沖洗干凈備用。 為了保證制種工作的順利進(jìn)行，提高制種成品率，應(yīng)首先對玻璃器皿進(jìn)行嚴(yán)格的洗滌和滅菌。 玻璃器皿的洗滌與滅菌 (3)用70%酒精棉球擦手，然后伸進(jìn)接種箱內(nèi)操作。 (1)每次接種前用5%石炭酸在接種箱內(nèi)壁和空間噴霧。 ②接種箱的使用規(guī)程 (6)接種時(shí)如遇棉塞著火，用手緊握即可熄滅，或用濕布撲滅，切勿用嘴吹滅，以免擴(kuò)大火焰。 用畢的火柴桿，廢紙不要扔在地上，應(yīng)放在專用的瓷盆里。 (4)接種前，用70%的酒精棉球擦手，然后按常規(guī)在火焰上進(jìn)行各項(xiàng)操作。 (2)進(jìn)入緩沖室，穿上無菌工作服、鞋、戴好口罩、工作帽，然后用2%煤酚皂液將手浸洗2分鐘。 要想達(dá)到無菌操作的目的，必須嚴(yán)格在接種室和接種箱的操作規(guī)程。接種室和接種箱的操作規(guī)程 接種箱較小，%的升汞溶液進(jìn)行噴霧，達(dá)到消毒滅菌。 石炭酸噴霧的優(yōu)點(diǎn)是：操作簡易、性質(zhì)穩(wěn)定。 缺點(diǎn)是：有一定的毒性和刺激氣味，且受溫度影響大。 無論哪一種方法熏蒸，都應(yīng)隔天才能接種。先密閉門窗，量取相應(yīng)的福爾馬林置于容器中，然后加入相應(yīng)的高錳酸鉀，操作者隨即離開接種室，熏蒸50分鐘即能達(dá)到消毒滅菌的目的。①熏蒸前噴灑水霧，以增加殺菌效果②注意防止金屬品銹蝕乙醇（酒精）皮膚、器皿、分離材料的表面消毒配成70%～75%的溶液擦拭易燃，使用時(shí)注意安全苯酚（石炭酸）接種室、接種箱空間消毒及物體表面殺菌①配成5%溶液在空間或物體表面上噴霧②3%溶液用于器械浸泡對皮膚有腐蝕作用來蘇兒（含煤酚皂47%～53%）手及物體表面消毒①3%溶液浸泡器皿1h②1%～2%溶液擦洗接種箱、無菌室、用具以及手的浸泡漂白粉床架、地板、墻壁、用具等的消毒配成2%～5%水溶液洗刷殺菌效力持續(xù)時(shí)間短，應(yīng)隨配隨用高錳酸鉀床架、器皿等表面消毒%～%水溶液刷洗或浸泡隨配隨用新潔爾滅（含季胺鹽5%）皮膚和不耐熱物品的表面消毒%的水溶液刷洗或浸泡升汞分離材料、非金屬物品的表面殺菌%～%水溶液刷洗或浸泡①配制時(shí)，升汞先溶于濃鹽酸（）再用水稀釋②劇毒，使用時(shí)注意安全冰醋酸（冰乙酸）空間消毒、非金屬物品的表面殺菌①噴霧：%，空間5ml～8ml/m3。②噴霧法：按1：50的比例配成水溶液噴射在物體上①福爾馬林有白色沉淀時(shí)，可加幾滴硫酸溶液②熏蒸法房間必要預(yù)先噴濕③對眼睛刺激性強(qiáng)，應(yīng)注意防護(hù)硫磺接種室、接種箱、培養(yǎng)室空間消毒或物體表面殺菌熏蒸法：按15g/m3的用量置磁碗內(nèi)，用紙片引火點(diǎn)燃。 其缺點(diǎn)是：對真菌殺傷力差，穿透能力弱。 照射時(shí)工作人員要離開室內(nèi)(避免肉眼觀看紫外線燈)，以防輻射影響身體健康。使用時(shí)應(yīng)注意，當(dāng)細(xì)菌接受致死量紫外線照射后，隨即給予可見光照射，其中有一部分細(xì)菌又有可能復(fù)活(稱光復(fù)活現(xiàn)象)。在每次接種前，應(yīng)將所需的器具一并移入接種室(箱)內(nèi)，然后打開紫外線燈進(jìn)行滅菌。 ①紫外線照射 例如：欲將95%的酒精配制成75%的酒精，按此方法計(jì)算，用75份濃酒精加入20份水，即為75%的酒精。 溶質(zhì)質(zhì)量＋溶劑質(zhì)量溶質(zhì)指被溶解的物質(zhì)；溶劑指能溶解溶質(zhì)的物質(zhì)，水是最常用的溶劑；質(zhì)量指重量，水的質(zhì)量一般以1g／ml計(jì)算。 x100% 溶液百分比濃度＝ 溶質(zhì)質(zhì)量 配制消毒劑時(shí)常用到百分比濃度。 (1)百分比濃度的計(jì)算 ③化學(xué)消毒劑的配制此外，細(xì)菌的芽孢，對同一或不同化學(xué)藥品的抵抗力，比其營養(yǎng)體大得多。不同微生物對各種消毒劑的敏感度不同，這主要是與其細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有關(guān)。 (3)微生物的種類與芽孢消毒劑的濃度也直接影響它的殺菌力，一般消毒劑的濃度越大，其殺菌力越強(qiáng)。消毒劑的化學(xué)性質(zhì)決定其殺菌力，它必須溶解于水，方可滲入微生物體內(nèi)而發(fā)揮作用。 (2)消毒劑的性質(zhì)與濃度一般講，溫度越高，殺菌效果越好，作用的時(shí)間越長，殺菌效果越好。 影響消毒劑上述作用的主要因素有以下幾種。 不同的消毒劑其殺菌或抑菌不同。 ②影響消毒劑作用的因素 一般用于劇毒藥劑熏蒸和某些不耐熱物品的徹底消毒滅菌。另一種方法是把要消毒的物品放在特殊的密閉容器中，先抽凈物品孔隙里的空氣，再通入殺菌氣體。用加熱、焚燒、氧化等方法，使化學(xué)藥劑為氣體狀態(tài)擴(kuò)散到空中，殺死空氣和物體表面的微生物。 (1)氣態(tài)消毒法 理想的消毒劑應(yīng)是殺菌力強(qiáng)、價(jià)格低、能長期保存、無腐蝕性、對人無毒或毒性較小的化學(xué)藥品。用于殺滅雜菌的藥物稱為消毒劑。在生產(chǎn)液體菌種的深層發(fā)酵工藝中，需要大量無菌空氣，采用氣體過濾方法，使空氣通過多層棉花和活，哇炭，濾除空氣中的微生物。 (2)氣體過濾～，濾除一般細(xì)菌，～，過濾時(shí)間不宜過長，因低壓能使屈曲運(yùn)動的細(xì)菌通過濾器；也要避免高度減壓，因微小顆粒會堵塞濾板，而失去過濾效能。將膜剪成與特制過濾器的漏斗直徑大小相仿的圓片，置漏斗上，再將過濾器裝在抽濾瓶上，以橡皮管連接抽濾瓶與安全瓶(中間可連一水銀檢壓計(jì))，最后將安全瓶用橡皮管接于真空泵上(圖4—6)。 現(xiàn)以濾膜過濾器為例介紹具體安裝和使用。過濾器的種類很多，主要有瓷土制過濾器，硅藻土制過濾器、濾膜過濾器等。 常見的試管口上加棉塞，就是起過濾除菌作用。 紫外線對人的眼粘膜及視神經(jīng)有損傷作用，應(yīng)避免直接在紫外燈下工作，更不能直視燈管。由于紫外線穿透物質(zhì)的能力很差，所以只適用于空氣和物體表面的滅菌。紫外線滅菌是用紫外線燈管進(jìn)行的。紫外線滅菌是利用輻射因素來滅菌的方法之一。 ③紫外線滅菌這樣殺滅細(xì)菌芽孢所需的時(shí)間可大大縮短，所以是一種最有效的滅菌方法。以上兩種蒸汽滅菌法，由于是在常壓下進(jìn)行，蒸汽溫度只有100℃左右，熱處理較長。 (4)高壓蒸汽滅菌做法與間歇滅菌法相似，但需延長熱處理的時(shí)間(4～8h)，使物品中的微生物營養(yǎng)體和芽孢全部死亡，達(dá)到一次性滅菌的目的。 間歇滅菌法常用于不耐高溫物品的滅菌。如此連續(xù)三次，即可殺死滅菌物的全部芽孢，達(dá)到滅菌的目的。物品放在蒸鍋或蒸籠內(nèi)，加熱至蒸汽上冒后，再繼續(xù)蒸煮15～20分鐘(根據(jù)不同的物品而定)，以殺死其中的微生物營養(yǎng)細(xì)胞。 栽培食用菌時(shí)常用的培養(yǎng)料發(fā)酵，即利用這個原理殺死其中的有害微生物。即用較低的溫度(60℃～700℃)殺死物品中的病原菌和大多數(shù)細(xì)菌白勺營養(yǎng)體。 主要介紹經(jīng)常用的巴斯德消毒法、間歇滅菌法、常壓滅菌法和高壓滅菌法。如用熱水、熱蒸汽殺死微生物。 其優(yōu)點(diǎn)是可以保持物品的干燥。將需要滅菌的物品置于干燥箱中，加熱到160℃，保持1～2h，利用箱內(nèi)的熱空氣殺死物體上的微生物。 (2)干熱滅菌嚴(yán)重污染雜菌的菇體和物體也可用火焰灼燒而滅菌。此方法的特點(diǎn)是操作簡便、滅菌迅速徹底。 在干燥的條件下，加熱進(jìn)行滅菌。 ①干熱法 物理方法 即操作的空間(如接種室、接種箱的空間)，使用的器皿和工具，操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。⑥無菌操作通過殺菌或抑菌達(dá)到防止物品腐敗霉變的目的。⑤防腐　 經(jīng)過滅菌后的物品就是無菌的。 具有這種作用的藥劑為抑菌劑。 具有這種效力的藥劑稱為殺菌劑。 是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把有生命的物質(zhì)全部殺死。 滅菌就食用菌生產(chǎn)而言，消毒是殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再危害食用菌的生長發(fā)育。消毒原是醫(yī)學(xué)上的一個概念。消毒我們通常將這類有害的微生物統(tǒng)稱為雜菌。 微生物在自然界中無處不有，土壤里、水中、空氣里、人體上、動植物體上以及培養(yǎng)食用菌的培養(yǎng)料、設(shè)備、工具上都有微生物存在。 表22　塑料燃燒特征塑料名稱聚丙烯（ＰＰ）聚乙烯（ＰＥ）聚氯乙烯（ＰＶＣ）燃燒狀易燃易燃難燃離火后繼續(xù)燃燒繼續(xù)燃燒熄滅火焰特點(diǎn)底部藍(lán)色，頂部黃色底部藍(lán)色，頂部黃色底部綠色，頂部淺綠色或黃色燃燒現(xiàn)象熔化淌滴，膨脹，有少量黑煙熔化淌滴，無黑煙軟化，能拉白絲冒白煙燃燒氣味石油味燃燒蠟燭的氣味鹽酸樣刺激氣味消毒與滅菌 塑料鑒別可采用簡便易行的灼燒法。 聚氯乙烯塑料有毒，不到100℃就軟化。　進(jìn)行高壓蒸汽滅菌時(shí)，宜用聚丙烯塑料袋，(6絲)為宜。其中高壓聚乙烯塑料袋透．明度高于低壓聚乙烯塑料袋，(厚度相同時(shí))，且低壓聚乙烯能耐120℃高溫。 下面是選擇塑料袋的根據(jù)和鑒別塑料袋的一般方法。 具體品種、規(guī)格和用途見表2１。塑料容器較輕便，成本低，但較易污染雜菌，且不易重復(fù)使用(薄膜容器)。玻璃容器透明度好，污染率低，但價(jià)格較高，且易損壞。 用于烘干測定產(chǎn)品及配料等的含水量，以及各種玻璃器皿的干熱消毒。 電熱干燥箱 顯微鏡是貴重的光學(xué)儀器，使用時(shí)應(yīng)嚴(yán)格操作程序，平時(shí)應(yīng)避免和酸堿、氯仿、乙醚、酒精等放在一處，以免受腐蝕。 是采取菌類孢子的一種專用裝置，它是由有孔鐘罩、搪瓷盤、培養(yǎng)皿、不銹鋼絲支架和紗布等組成(見圖4—8)。 孢子采集器 無條件的單位自己可制造干濕球溫度計(jì)。例如：干球溫度計(jì)讀數(shù)為18℃，濕球溫度計(jì)讀數(shù)為16℃，在溫、濕度換算表縱行中查找18℃，再查橫行干、濕溫度差為2℃，其垂直交叉處的讀數(shù)為76，即空氣相對濕度為76%。其中1支溫度表的水銀柱頭，用易吸水的紗布條包裹扎牢，紗布的另一端放入裝有清水的小瓶內(nèi)作為濕球，即成為自制干濕球溫度計(jì)。購買2支普通溫度表(用前最好進(jìn)行校對)，找一個薄木板，將2支溫度表并列固定在木板上。 在縱行22℃，即說明空氣相對濕度73%。旋轉(zhuǎn)制動螺絲，對準(zhǔn)其差數(shù)，差數(shù)與干球溫度垂直交叉處的讀數(shù)即為空氣的相對濕度。 常用的是市售干濕球溫度計(jì)，可同時(shí)觀察環(huán)境的溫度與濕度。 干濕溫度計(jì) 實(shí)驗(yàn)室常用的儀器設(shè)備有天平、干濕溫度計(jì)、玻璃器皿和器具、孢子采集器、光學(xué)顯微鏡、電冰箱、冷藏箱及電熱干燥箱等，可根據(jù)單位的具體條件設(shè)置。 旋轉(zhuǎn)式的耐用，效果較好。往復(fù)式搖瓶機(jī)的搖蕩頻率是每分鐘80～120次，振幅(往復(fù)距)為8cm～12cm。 食用菌進(jìn)行深層培養(yǎng)或制備液體菌種時(shí)，需設(shè)置搖瓶機(jī)。 搖瓶機(jī)(搖床)因此可以用木板自己制造。 在制作母種和少量原種時(shí)，可采用恒溫培養(yǎng)箱，根據(jù)需要使溫度保持在一定范圍內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。 恒溫培養(yǎng)箱室內(nèi)放置菌種培養(yǎng)架。 恒溫培養(yǎng)室用于培育栽培種或培育較多的母種和原種。 恒溫培養(yǎng)室 用于原種和栽培種轉(zhuǎn)接的工具，因培養(yǎng)基比較粗糙緊密，可用比較粗大的不銹鋼制成。 接種工具是指分離和移接菌種的專用工具，樣式很多。 接種工具 因此，潔凈氣流不僅可以造成無塵環(huán)境，而且也是無菌環(huán)境。由于潔凈的氣流是勻速平行地向著一個方向。 超凈工作臺是一種局部層流(平行流)裝置，能夠在局部造成潔凈的工作環(huán)境。 超凈工作臺 箱體安裝玻璃，木板均要注意密封，箱的內(nèi)外均用油漆涂刷。箱前(或箱后)的兩個圓孔裝上40cm長的布袖套或橡皮手套，雙手由此伸入操作。 目前多數(shù)生產(chǎn)者采用木材和玻璃自己加工制作成一人或雙人操作箱，其樣式和大小大致。 接種箱是供菌種分離，移接的專用木制箱，實(shí)際上是縮小的接種室。接種箱 接種室具有操作方便，接種量大和速度快等優(yōu)點(diǎn)，適宜于大規(guī)模生產(chǎn)。接種室內(nèi)的地面和墻壁要求光滑潔凈，便于洗清消毒。接種室外面設(shè)緩沖間，面積約2m2。 生產(chǎn)量較大的菌種廠，應(yīng)充分注意各個工作間的位置安排，總體布局參見下圖。 接種室又稱無菌室，是進(jìn)行菌種分離和接種的專用房間。 接種室 采用蒸籠滅菌時(shí)，密閉條件較差，由于鍋內(nèi)溫度最高是100℃，所以滅菌時(shí)間從溫度達(dá)100℃開始計(jì)時(shí)，需保持6～9h。 土蒸鍋形式簡單，制作簡易，可以就地取材，造價(jià)低廉，但殺菌時(shí)間較高壓鍋長。門上附有放溫度計(jì)的小孔，鐵鍋上沿設(shè)有進(jìn)出水管。用磚砌成灶，灶上用磚和水泥砌成桶狀或方形蒸汽室，底部為大鐵鍋。 ①土蒸鍋 菌種袋(瓶)放入鐵提籃內(nèi)，吊入鍋中，一般約放4～5層，每鍋裝800～1000袋(瓶)，適合于專業(yè)菌種廠制作栽培種培養(yǎng)基的滅菌。鍋口用緊固的螺絲擰緊密封，鍋上安裝壓力表、溫