【正文】 本實(shí) 驗(yàn)對(duì)植物總蛋白提取最常用和經(jīng)典的四種方法提取的半夏總蛋白質(zhì)量進(jìn)行比較分析，尋找 半夏總蛋白提取較優(yōu)的方法。半夏總蛋白的提取沒有確定的方法，目前最常用的方法是 (NH4)2S04分段鹽析法，此法只能提取某一飽和度(NH4)2S04下半夏的總蛋白，孫光星等【6n 用生理鹽水為提取液用丙飼沉淀的方法提取掌葉半夏總蛋白，但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該法不能充 分提取半夏總蛋白。/o SDSPAGE電泳 檢測結(jié)果一致，從蛋白電泳行為和蛋白濃度兩方面推定TCA丙爾法是最佳的半夏總蛋白 提取方法，故半夏總蛋白的提取采用TCA丙雨法。/。 Table A595 value of total protein in Pinellia ternata of the three repeat experiments編號(hào)A595(n=l)A595(n=2)A595(n=3)I234《定結(jié)果 Table Results ofdetermation of total protein content in PinelUa ternata extracted by four differentmethods編號(hào)濃度(mg/mL) (n=濃度(mg/mL) (n=2)濃度(mg/mL) (n=3)I234注：I:丙飼沉淀法2: 95%(NH4)2S04鹽析法3: TCA丙觸法4: Tris飽和紛法由標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算三次重復(fù)四種方法提取的半夏總蛋白濃度。 b: The standard curve of experiment 2。浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文s* 7 6 5 4 3 2 IANV Av AM O A—^ AM^ay=+ R*39。4： Tris*equilibrium phenol precipitation 總蛋白的含量測定三次重復(fù)四種不同方法提取半夏總蛋白’取相同質(zhì)量的材料，提取的蛋白質(zhì)溶液定容 至同一體積，均取10^11^上樣，經(jīng)15% SDSPAGE電泳檢測，結(jié)果顯示，95%(NH4)2S04 鹽析法和TCA丙飼法提取效果相對(duì)較好，丙雨法提取的總蛋白條帶最淡，Tris飽和酣法 提取的總蛋白條帶相對(duì)濃于丙雨法提取的總蛋白。 2:95% saturated ammonium sulfate precipitation。|M力一 ——M I 2 3 4mm T 4 B$m MtdIlitmMMA% SDSPAGE電泳圉M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)( kDa) I:丙雨沉淀法2: 95o/o(NH()2S04鹽析法 3： TCA丙觸法4: Tris飽和粉法 Fig. Results of 15% SDSPAGE electrophoresis of total protein in Pinellia ternata M: Unstained protein molecular weigh maker ( kDa)。 I I 衫力,i 39。I5i^171。^pf M I 2 39。四種方法提取的總蛋白中12kDa和24kDa的蛋白含量均很高，是塊蓮中的主要蛋白，半夏是真核生物， 但其總蛋白條帶少，原因可能是在干燥處理過程中含量低、分子量大的蛋白發(fā)生降解，對(duì) 熱不穩(wěn)定，在變性膠電泳處理過程中蛋白質(zhì)也因發(fā)生變性而降解，而12 kDa、24 kDa和 35kDa對(duì)熱穩(wěn)定，變性處理時(shí)也相對(duì)穩(wěn)定。四種方法提取半夏總蛋白15% SDSPAGE電泳行 為：蛋白條帶都主要出現(xiàn)在12kDa和24kDa處,在35kDa處也有條帶出現(xiàn)，蛋白電泳行 為沒有很大差別。 19浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文總蛋白含量測定方法參考Bradford蛋白濃度測定試劑盒，具體步驟如下：1) 取8支(或者更多)干凈的試管，編號(hào)；2) 取 100 HL BSA,加 PBS mL 稀釋至終濃度為 mg/mL；3) 5xG250染色液使用前顛倒35次混勾，取10 mL 5G250染色液，加入40mL雙蒸水, 混勾成1XG250染色液，此1XG250染色液可在4 T保存一周；4) (以每孔5 ml計(jì)，多余的用來清洗比色皿表2,2 Bradford蛋白濃度測定操作表 Table Procedure for determination of protein of Bradford method離心管編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA體積(nL,已稀釋）PBS 體積(JiL)1XG250染色液體積(mL)IO5005210040053200300543002005540010056500O57(樣品I)500 JiL造當(dāng)稀釋的樣品IO58(樣品2)500 HL適當(dāng)稀釋的樣品2O59(樣品3)O55) 反應(yīng)3min后，在595 nm處測吸光值A(chǔ),并記錄。染色至少2 h。4) 電泳：上樣后接通電源，上槽接電源負(fù)極，下槽接正極，開始電流控制在1520 mA, 當(dāng)染料進(jìn)入分離膠后，調(diào)為30 mA,電壓在80120 V,漠盼藍(lán)距凝膠邊緣約5 mm時(shí)，停 止電泳。3) 上樣：將膠板固定于垂直電泳槽中，倒入電泳緩沖液，沒過樣梳。2) 樣品制備：將樣品制備成合適的濃度，分別取樣品10 HiL離心管中，再分 別加入IOhL 2X上樣緩沖液，混勾后IOOT金屬浴加熱3 min,取出稍離心，待用。將按比例配好 的5HiL分離膠溶液倒入槽中，加入2mL蒸饋水，放置約30min,水層和膠層接觸面出現(xiàn) 清晰而直的界面，將蒸館水倒出，用吸水紙吸千剩余的水，倒入按比例配好的2 HiL濃縮 膠，小心插入樣梳。(：，12,000 rpm,離心 35 min,取上清，20 T 保存。9) 4176。C過夜；7) 4176。5) 13 174。2) 4176。C, 12,000 rpm,離心35 min,取上清即可。C揮干，即得到所需干粉；6) 蛋白千粉加入4倍體積的裂解液，潤旋，靜置30min。4) 4176。C靜置過夜；2) 4176。C 保存。C, 12,000 rpm,離心 20min,取上清；3) 加入固體(NH4)2S04使飽和度至95%,加(NH4)2S04過程中要勾速摸摔；4) 4T,鹽析過夜，然后4T, 12,000 rpm,離心20min,棄上清；5) 沉淀用PBS溶解,溶解液在4 176。95o/o(NH4》2S04 鹽析法：I)將半夏洗凈去皮千燥至恒重，置研鉢中研磨至粉狀，加入5倍體積的提取緩沖液(PBS)浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文浸泡24h。 實(shí)驗(yàn)攤 卿沉淀法：1) 將半夏洗凈去皮干燥至恒重，置研鉢中研磨至粉狀，加入5倍體積的提取緩沖液(PBS) 浸泡24 h；2) 4 T, 12,000 rpm,離心 20min,取上清；3) 加入2倍體積4 C預(yù)冷的丙雨，混勾后靜置IOmin,有絮狀沉淀產(chǎn)生。C保存；10% SDS: Ig SDS溶解液IOmL蒸館水中，室溫保存；10%過硫酸按(10%AP): Ig過硫酸按溶解于IOmL蒸館水中，現(xiàn)用現(xiàn)配，4。C可保存一個(gè)月；分離膠Buffer(): 40mL雙蒸水溶解，濃鹽酸調(diào)pH ,雙蒸水定容至50 mL, 4。三氛醋酸(TCA)丙願(yuàn)法提取液：lOo/%的|3琉基乙醇的丙飼；Tris飽和酌法蛋白沉淀液：% M乙酸按甲醇溶液；蛋白質(zhì)裂解液：8mol/L腺素、4% CHAPS和1%DTT。 三氛醋酸(TCA)、 脈素、CHAPS、二硫蘇糖醇(DTT)、Tris飽和盼、甲酵、十二貌基硫酸納(SDS)、濃鹽酸、甘油、漠盼藍(lán)、過硫酸按(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、N. N甲叉雙丙煉酸胺、 丙煉醜胺、甘氛酸、冰乙酸、考馬斯亮藍(lán)R250,蛋白標(biāo)準(zhǔn)marker(購于Fementas公司)， Bradford蛋白含量測定試劑盒。 KH2PO439。 ZD9556水平搖床(太倉市科教器材廠)；連續(xù)波長生 物分析儀等。尋找提取半夏總蛋白的最佳方法，是研究不同生長時(shí)期半夏塊蓮 總蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化的基礎(chǔ)和基本環(huán)節(jié)。迄今，國內(nèi)外關(guān)于半夏總蛋白提取的研究較少，傳統(tǒng)的提取半夏 總蛋白的方法是硫酸按鹽析法’該法提取的蛋白電泳條帶少，結(jié)果不甚理想。其中半夏蛋白在半夏眾多的化學(xué)成分中具有明顯的生物活性， 是半夏抗腫瘤、抗生育及殺蟲等藥理作用的主要有效成分【93】。浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章半夏總蛋白的提取及含董測定半夏為天南星科半夏屬半夏化7 ,mwto(Thunb.)Breit.)的干燥塊基，具有燥濕化痰、 降逆止嘔、消宿散結(jié)之功效，是常用中1^。半夏蛋白主要是半夏凝集素，半夏凝集素作為半夏類藥材中的主要藥效成分，具 有其特定的化學(xué)和生物學(xué)特性，可以應(yīng)用到生物化學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，免疫學(xué)，醫(yī)學(xué)，藥學(xué)， 基因工程和植物保護(hù)等多個(gè)方面，故研究半夏蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)更深入的研究半夏 蛋白的藥理活性及充分利用其研究開發(fā)新藥有重要意義。13浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文半夏是我國重要的中藥材，其入藥首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主要以塊蓮入藥，具有抗 早孕、抗腫瘤、鎮(zhèn)咳、抗清蕩、抗心律失常、降血脂、鎮(zhèn)靜催眠、解毒抗炎、殺蟲等作用。李淑 潔等【9^也用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將半夏凝集素基因轉(zhuǎn)入油菜中，獲得抗性植株，為創(chuàng)造轉(zhuǎn) 基因抗蟲池菜新種質(zhì)提供研究基礎(chǔ)。近年來的研究表明，植物凝集素有抗蟲的作用，利用抗蟲基因進(jìn) 行害蟲防治是一種保護(hù)農(nóng)作物不受侵害的經(jīng)濟(jì)有效的措施。徐陶等【^176。半夏凝集素(PTA)為半夏的主要蛋白之一，王克夷等【62]用固定化豬甲狀腺球蛋白親和 層析分離得到半夏凝集素,經(jīng)凝膠過濾、SDSPAGE和免疫雙擴(kuò)散鑒定,其分子量約44 kDa, 由四個(gè)約12 IcDa的亞基組成。 王克夷等【88】用豬甲狀腺球蛋白親和層析柱分離純化得到了半夏貼。半夏蛋白分離純化的經(jīng)典方法是硫酸按鹽析法【761,陶宗晉等聯(lián)合鹽析法和結(jié)晶 法得到半夏蛋白晶體《 Kiyoshi等【79】通過凝膠電泳和離子交換層析法，從天然半夏塊蓬球 蛋白中分離出了 6kDa的糖蛋白。半夏蛋白是半夏主要藥效成分之，因此分離純化半夏蛋白是研究其藥理作用必須的 一個(gè)環(huán)節(jié)。裴建文等【**7】利用紫外法研究了施肥對(duì)半夏總 蛋白含量的影響，發(fā)現(xiàn)氨肥施量的多少對(duì)蛋白質(zhì)含量高低起重要作用。但此法會(huì)受總蛋白中酪氨酸含量的影響，實(shí)驗(yàn)過程中需要校正。目前中藥材中蛋白質(zhì)含量測定的方法有很多，常用的方法有：紫外分光光度 法、Folin盼試劑法、雙縮腺法和改良的考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)，根據(jù)各法的靈敏度、精確度、實(shí)驗(yàn)條件、花費(fèi)時(shí)間及樣品蛋白的性質(zhì)等選擇合適的方法。陶宗晉等【84]還對(duì)半夏蛋白抗小鼠早孕的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，結(jié)果表明半夏蛋白 通過使孕飼分泌量下降而起抗早孕作用的，但半夏蛋白調(diào)節(jié)孕雨下降的機(jī)制尚需進(jìn)一步研 究。半夏蛋白的凝血、凝集細(xì)胞的作用及便細(xì)胞分 裂的作用均具有動(dòng)物種屬專一性或細(xì)胞類別?！鲂?981年，陶宗晉等【7174。凝集作用，半夏蛋白有凝血和凝集細(xì)胞的活性，其不能凝集人、猴、豬、龜、 蟾餘等的紅細(xì)胞，只凝集哺乳類動(dòng)物如羊、狗、貓、兔等的紅細(xì)胞；半夏蛋白也能與許多 細(xì)胞結(jié)合，其能凝集小鼠淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)，艾氏腹水癌細(xì)胞、腹水型肝癌細(xì)胞(HepA), 大鼠紅細(xì)胞等，但不凝集大鼠附華和豬大網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞。題還需進(jìn)一步研究。(：溶液中的變性是可逆的，80T時(shí)部 分變性，部分可逆。 Tao Z J等[78】的熱變性實(shí)驗(yàn)表明半夏蛋白在55。半夏蛋白對(duì)酸、堿、鹽和熱相對(duì)穩(wěn)定。1amp。孫光星等【431分離出了掌葉半夏總蛋白，經(jīng)化學(xué)分析證實(shí)總 蛋白含有糖成分，是糖蛋白；經(jīng)SDSPAGE分析，總蛋白中含有10余種蛋白，蛋白含量 %。 陶宗晉等[761首次從三葉半夏鮮汁中用結(jié)晶法得到半夏蛋白，其用凝膠滲透色譜分析法 測定半夏蛋白分子量為44 kDa。對(duì)已克隆的凝集素基因序列的分析進(jìn)一步證 實(shí)了凝集素分類的正確性，所有的單子葉植物甘露糖結(jié)合凝集素基因和豆科凝集素基因均 分別顯示出很高的序列同源性。]、香薫凝集素【69】、石蒜凝集素基因f174。分離純化的樣品還要用一定的方法如SDSPAGE或HPLC檢測純 化效果。層析法根據(jù)原理不同可分為：親和層 析(特異性配基Sepharose、豬甲狀腺球蛋白親和柱)、離子交換層析(陰離子交換層析 DEAESepharosex 陽離子交換層析 CMSepharose)、分子蹄層析(Sephadex、Sephacry)。在植物凝集素的提取中常用(NH4)2S04分段沉淀，因(NH4)2S04在水中的溶解 度大且溫度系數(shù)小，該法的缺點(diǎn)是不能得到純化的蛋白。從浸提效果看，蒸館水的提取效果最差【^】。由于植物凝集素在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及農(nóng)業(yè)等上的廣泛應(yīng)用，使得提取純化天然植物凝集 素非常重要。a、具有凝集作用，研究表明不同凝集素對(duì)不同動(dòng)物血細(xì)胞有獨(dú)立特異性凝集 作用【^’53】；b、具有促淋巴細(xì)胞有絲分裂和凝集癌細(xì)胞的作用【54’55]。植物凝集素在植物界廣泛分布，且在植物體內(nèi)也非常豐富，這與植物凝集素具有多種 功能是分不開的。20世紀(jì)70年代， 科研工作者就開始了對(duì)植物凝集素分子結(jié)構(gòu)的研究，70年代末，已完成了 6種植物凝集 素的全序列測定，同時(shí)還借助X晶體衍射的方法分析了 ConA的三級(jí)結(jié)構(gòu)至近幾年， 有約200個(gè)凝集素的三級(jí)結(jié)構(gòu)被鑒定出來。 其與糖的結(jié)合是通過分子肚鏈中的活性部位實(shí)現(xiàn)的，與其分子中共價(jià)結(jié)合的糖無關(guān)[5^171。植物凝集素是一類高度異質(zhì)性的具有糖特異性可逆結(jié)合活性的蛋白或糖蛋白，因其能 凝集紅細(xì)胞，故名凝集素，亦稱外源凝集素。1998年，Peumans等報(bào)道植物凝集素存在于儲(chǔ)藏器官中，它旣是一種氨源，又具 有防御功能科研工作者對(duì)植物凝集素從發(fā)現(xiàn)到給予恰當(dāng)?shù)亩x經(jīng)歷了近百年