db51t1203-20xx馬鈴薯m病毒、馬鈴薯s病毒檢疫鑒定技術(shù)規(guī)程doc(參考版)
2025-07-18 11:33本頁面
【正文】 XIV。電泳緩沖液1TAE適量，100 V，電泳30 min。L的溴酚藍(lán)上樣緩沖液混勻，以及2 181。L）11414 反應(yīng)程序 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 sec，59 ℃ 30 sec，72 ℃ 30 sec，30次循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存?！?PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系?！?馬鈴薯S病毒RT反應(yīng)體系反應(yīng)物模板RNAP2RNasinRT Ehancer5 RT bufferdNTPMMLV無RNA酶的ddH2O加入量（181。EE附 錄 E （資料性附錄）馬鈴薯S病毒RTPCR檢驗(yàn)程序 PVS模板RNA的制備。電泳緩沖液1TAE適量，100 V，電泳30 min。L的溴酚藍(lán)上樣緩沖液混勻，以及2 181。L）11414 反應(yīng)程序 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3 min；94℃30 sec，59℃30 sec，72℃30 sec，30次循環(huán)；72℃10 min；4℃保存?！?PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系?！?馬鈴薯M病毒RT反應(yīng)體系反應(yīng)物模板RNAP2RNasinRT Ehancer5 RT bufferdNTPMMLV無RNA酶的ddH2O加入量（181。L無RNA酶的雙蒸水，室溫放置2 min，12000 rpm離心2 min，得到RNA溶液。將吸附柱放入一個(gè)新的RNasefree離心管中，向膜中央加入50 181。L漂洗液RW，12000 rpm離心1 min，棄廢液，將吸附柱放回收集管中，重復(fù)漂洗一次。L去蛋白液RW1，12000 rpm離心1 min，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。混勻，得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入CR吸附柱中，12000 rpm離心1 min,棄掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。L），渦旋劇烈震蕩5 min使其混勻。稱取50 mg～100 mg的馬鈴薯葉片或莖桿（薯塊需經(jīng)發(fā)芽后切取幼芽），在液氮中迅速研磨成粉末狀， mL的EP管中，加入500 181。 結(jié)果測(cè)定和記錄用酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定并記錄光密度值（OD值）。 終止反應(yīng)顯色后在每孔中加入50 μL 終止液?！?顯色每孔加入100 μL 底物溶液。置于保濕容器中室溫孵育2 h。洗板完成后將酶聯(lián)板倒置于吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中殘留液體。 洗板在每個(gè)反應(yīng)孔加滿洗滌液，迅速倒出，再加滿洗滌液，靜置3 min后將洗滌液迅速倒出。設(shè)置陽性對(duì)照、馬鈴薯健康組織研磨液陰性對(duì)照和包被緩沖液空白對(duì)照。剩余樣品于20℃冰箱保存?zhèn)洳?，在制樣時(shí)應(yīng)注意防止樣品的交叉污染。洗板完成后將酶聯(lián)板倒置于吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中殘留液體。CC附 錄 C （資料性附錄）馬鈴薯S病毒DASELISA檢驗(yàn)程序 包被抗體 包被向酶聯(lián)反應(yīng)板每孔加入100 μL用包被緩沖液稀釋的PVS捕捉抗體，將酶聯(lián)反應(yīng)板置于保濕容器中，室溫孵育4 h 或4 ℃冰箱過夜。記錄檢測(cè)結(jié)果，存檔備查。25℃避光孵育30 min～60 min,至陽性對(duì)照顯色。 洗板 。 結(jié)合酶標(biāo)抗體 加酶標(biāo)抗體向酶聯(lián)反應(yīng)板每孔加入100 μL用PVM酶標(biāo)抗體稀釋緩沖液按比例稀釋的酶標(biāo)抗體溶液。重復(fù)3次。加樣完成后將酶聯(lián)反應(yīng)板置于保濕容器中，室溫孵育2 h或4℃冰箱12 h?！?點(diǎn)樣用移液器將制備好的樣品加入酶聯(lián)反應(yīng)板孔內(nèi)，每個(gè)樣品三次重復(fù)，每孔100μL?！?點(diǎn)樣 樣品制備將待測(cè)樣品剪碎， g于研缽中，加入1 mL樣品提取液充分研磨后，再加入2 mL樣品提取液充分研磨至均勻?！?
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