db51t1203-20xx馬鈴薯m病毒、馬鈴薯s病毒檢疫鑒定技術規(guī)程doc(更新版)
【正文】 錄）馬鈴薯S病毒RTPCR檢驗程序 PVS模板RNA的制備。L的溴酚藍上樣緩沖液混勻，以及2 181。電泳緩沖液1TAE適量，100 V，電泳30 min?！?馬鈴薯S病毒RT反應體系反應物模板RNAP2RNasinRT Ehancer5 RT bufferdNTPMMLV無RNA酶的ddH2O加入量（181。L）11414 反應程序 反應程序為：94℃3 min；94℃30 sec，59℃30 sec，72℃30 sec，30次循環(huán)；72℃10 min；4℃保存。將吸附柱放入一個新的RNasefree離心管中，向膜中央加入50 181。L），渦旋劇烈震蕩5 min使其混勻?！?顯色每孔加入100 μL 底物溶液。設置陽性對照、馬鈴薯健康組織研磨液陰性對照和包被緩沖液空白對照。記錄檢測結果，存檔備查。重復3次?！?洗板向每個反應孔中加入200 μL洗滌液，迅速倒出，重復2次。植株受PVM浸染后，溫度在24℃以上，病癥隱蔽。病毒粒體微曲線狀，大小65012nm，致死溫度65～71℃，稀釋限點100～1000倍，20℃體外存活期幾天?！?馬鈴薯S病毒樣品的制備與檢驗方法見附錄E。7 取樣 植株取樣取樣方法按DB51/T8682009 ?！?2巰基乙醇（MCE）C2H6OS。 RT增強劑（RT Ehancer）。底物溶液制備需在孵育結束前15 min內，避光條件下制備。 用堿性磷酸酶標記的馬鈴薯S病毒的免疫球蛋白抗體。采用免疫學和分子生物學方法，可快速根據有關判斷標準進行馬鈴薯M病毒、馬鈴薯S病毒檢驗鑒定。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。本標準由四川省農業(yè)廳提出并歸口?！? 目標條帶 target band根據某種病毒RNA序列中一段保守的、特異的堿基序列設計特異引物，通過RTPCR擴增和電泳檢測，得到的與引物設計長度吻合的RTPCR擴增條帶。貯藏于4℃條件下備用。 洗滌液(PBST Buffer) g無水磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、 g氯化鉀（KCl）、 g無水磷酸二氫鉀（KH2PO4）、 g氯化鈉（NaCl）、 g吐溫－20 ，用1000 mL蒸餾水溶解。 1 TAE 緩沖液 40mM TrisHCl， 20mM NaAc， 2mM EDTA()?！?去蛋白液。 PVS上游引物（P1）堿基序列: 5＇ TTCCAGAGGACGCCTTTGCAATC3＇，下游引物（P2）堿基序列: 5＇ GTCTAACTGGCATCAGGGCACAATA3＇，用雙蒸水稀釋至20μM。如采用認可的試劑盒，按說明操作?！?RTPCR在陰性對照無擴增條帶，且陽性對照出現630 bp目標條帶的前提下，樣品RTPCR產物電泳結果在630 bp處出現目標條帶，判定為陽性反應，即樣品帶PVM病毒；否則判定為陰性反應，即樣品不帶PVM病毒。屬香石竹潛隱病毒屬?！?馬鈴薯S病毒為害癥狀馬鈴薯S病毒單獨侵染時常常不表現癥狀，可持續(xù)存在馬鈴薯薯塊中，并通過薯塊作遠距離傳播。剩余樣品于20℃冰箱保存?zhèn)洳?，在制樣時應注意防止樣品的交叉污染。置于保濕容器中室溫孵育2 h。 洗板向每個反應孔中加入200 μL洗滌液，迅速倒出，重復2次。重復3次。記錄檢測結果，存檔備查。向吸附柱CR中加入700 181。 RTPCR擴增 反轉錄 反應體系。L 100bp DNA ladder分別點入樣孔內?！?PCR反應體系反應物10PCR BufferdNTPP1P2cDNATaqDNA聚合酶MgCl2無RNA酶的ddH2O加入量（1
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