db51t1203-20xx馬鈴薯m病毒、馬鈴薯s病毒檢疫鑒定技術(shù)規(guī)程doc(更新版)
【正文】 錄）馬鈴薯S病毒RTPCR檢驗(yàn)程序 PVS模板RNA的制備。L的溴酚藍(lán)上樣緩沖液混勻，以及2 181。電泳緩沖液1TAE適量，100 V，電泳30 min?！?馬鈴薯S病毒RT反應(yīng)體系反應(yīng)物模板RNAP2RNasinRT Ehancer5 RT bufferdNTPMMLV無RNA酶的ddH2O加入量（181。L）11414 反應(yīng)程序 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3 min；94℃30 sec，59℃30 sec，72℃30 sec，30次循環(huán)；72℃10 min；4℃保存。將吸附柱放入一個(gè)新的RNasefree離心管中，向膜中央加入50 181。L），渦旋劇烈震蕩5 min使其混勻?！?顯色每孔加入100 μL 底物溶液。設(shè)置陽性對(duì)照、馬鈴薯健康組織研磨液陰性對(duì)照和包被緩沖液空白對(duì)照。記錄檢測(cè)結(jié)果，存檔備查。重復(fù)3次?！?洗板向每個(gè)反應(yīng)孔中加入200 μL洗滌液，迅速倒出，重復(fù)2次。植株受PVM浸染后，溫度在24℃以上，病癥隱蔽。病毒粒體微曲線狀，大小65012nm，致死溫度65～71℃，稀釋限點(diǎn)100～1000倍，20℃體外存活期幾天?！?馬鈴薯S病毒樣品的制備與檢驗(yàn)方法見附錄E。7 取樣 植株取樣取樣方法按DB51/T8682009 ?！?2巰基乙醇（MCE）C2H6OS?！?RT增強(qiáng)劑（RT Ehancer）。底物溶液制備需在孵育結(jié)束前15 min內(nèi)，避光條件下制備。 用堿性磷酸酶標(biāo)記的馬鈴薯S病毒的免疫球蛋白抗體。采用免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法，可快速根據(jù)有關(guān)判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行馬鈴薯M病毒、馬鈴薯S病毒檢驗(yàn)鑒定。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。 目標(biāo)條帶 target band根據(jù)某種病毒RNA序列中一段保守的、特異的堿基序列設(shè)計(jì)特異引物，通過RTPCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，得到的與引物設(shè)計(jì)長度吻合的RTPCR擴(kuò)增條帶。貯藏于4℃條件下備用?！?洗滌液(PBST Buffer) g無水磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、 g氯化鉀（KCl）、 g無水磷酸二氫鉀（KH2PO4）、 g氯化鈉（NaCl）、 g吐溫－20 ，用1000 mL蒸餾水溶解。 1 TAE 緩沖液 40mM TrisHCl， 20mM NaAc， 2mM EDTA()?！?去蛋白液?！?PVS上游引物（P1）堿基序列: 5＇ TTCCAGAGGACGCCTTTGCAATC3＇，下游引物（P2）堿基序列: 5＇ GTCTAACTGGCATCAGGGCACAATA3＇，用雙蒸水稀釋至20μM。如采用認(rèn)可的試劑盒，按說明操作。 RTPCR在陰性對(duì)照無擴(kuò)增條帶，且陽性對(duì)照出現(xiàn)630 bp目標(biāo)條帶的前提下，樣品RTPCR產(chǎn)物電泳結(jié)果在630 bp處出現(xiàn)目標(biāo)條帶，判定為陽性反應(yīng)，即樣品帶PVM病毒；否則判定為陰性反應(yīng)，即樣品不帶PVM病毒。屬香石竹潛隱病毒屬?！?馬鈴薯S病毒為害癥狀馬鈴薯S病毒單獨(dú)侵染時(shí)常常不表現(xiàn)癥狀，可持續(xù)存在馬鈴薯薯塊中，并通過薯塊作遠(yuǎn)距離傳播。剩余樣品于20℃冰箱保存?zhèn)洳?，在制樣時(shí)應(yīng)注意防止樣品的交叉污染。置于保濕容器中室溫孵育2 h?！?洗板向每個(gè)反應(yīng)孔中加入200 μL洗滌液，迅速倒出，重復(fù)2次。重復(fù)3次。記錄檢測(cè)結(jié)果，存檔備查。向吸附柱CR中加入700 181?！?RTPCR擴(kuò)增 反轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)體系。L 100bp DNA ladder分別點(diǎn)入樣孔內(nèi)?！?PCR反應(yīng)體系反應(yīng)物10PCR BufferdNTPP1P2cDNATaqDNA聚合酶MgCl2無RNA酶的ddH2O加入量（1
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