db51t1203-20xx馬鈴薯m病毒、馬鈴薯s病毒檢疫鑒定技術(shù)規(guī)程doc(完整版)
【正文】 稀釋緩沖液按比例稀釋的酶標(biāo)抗體溶液?！?點(diǎn)樣 樣品制備將待測樣品剪碎， g于研缽中，加入1 mL樣品提取液充分研磨后，再加入2 mL樣品提取液充分研磨至均勻?！?顯色每孔加入100 μL 底物溶液。設(shè)置陽性對照、馬鈴薯健康組織研磨液陰性對照和包被緩沖液空白對照。當(dāng)與馬鈴薯X病毒混合侵染時，可減產(chǎn)2030%。在馬鈴薯上引起輕度皺縮花葉或不顯癥，其寄主范圍較窄，系統(tǒng)侵染的植物僅限于茄科的少數(shù)植物 為害 馬鈴薯M病毒為害癥狀馬鈴薯M病毒寄主范圍窄，主要侵染茄科，還可侵染藜科和豆科植物。10 樣品保存經(jīng)檢疫鑒定后的樣品，應(yīng)在80℃～20℃保存三個月，以備復(fù)驗、談判和仲裁，保存期滿后，需進(jìn)行滅活處理。如采用認(rèn)可的試劑盒，按說明操作。 瓊脂糖凝膠 g瓊脂糖緩緩倒入250 mL三角瓶內(nèi)，加入100 mL 1TAE，在微波爐中加熱1 min溶解后，再加入5 181?！?dNTP Mixture 10 mM?！?10 PCR 緩沖液 100 mM TrisHCl ()， 500 mM KCl?！?酶標(biāo)抗體稀釋緩沖液（ECI Buffer） g牛血清白蛋白（或脫脂奶粉）、 g聚乙烯吡咯烷酮（（C6H9NO）n）、 g疊氮化鈉（NaN3），用100 mL洗滌緩沖液溶解，貯藏于4℃條件下備用。貯藏于4℃條件下備用。本標(biāo)準(zhǔn)中PVM的目標(biāo)條帶為630bp，PVS的目標(biāo)條帶為435bp。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：寧紅、萬佳、劉可、郭迪金、吳志平、黃玲、李耄IIDB51/T 1203—2011馬鈴薯M病毒、馬鈴薯S病毒檢疫鑒定技術(shù)規(guī)程1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了馬鈴薯M病毒（見附錄A）、馬鈴薯S病毒（見附錄A）的取樣、實驗室檢驗、結(jié)果判斷及樣品保存的技術(shù)要求和方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于馬鈴薯感染馬鈴薯M病毒、馬鈴薯S病毒的檢驗和鑒定。注：改寫DB51/T8682009,?！?酶標(biāo)抗體（Alkaline phosphatase enzyme conjugate） 用堿性磷酸酶標(biāo)記的馬鈴薯M病毒的免疫球蛋白抗體?！?底物緩沖液（PNP Buffer） 用80 g氯化鎂（MgCl2）、 g疊氮化鈉（NaN3）、 mL二己醇胺CH2CH2OH）溶解后，定容到100 mL，貯藏于4℃條件下備用?！?MgCl2 25 mM?！?漂洗液。L Goldview的生物染料，倒入調(diào)平并安放適當(dāng)梳齒的制膠板上，冷凝后小心拔出梳齒?！?RTPCR 馬鈴薯M病毒樣品的制備與檢驗方法見附錄D。AA附 錄 A （資料性附錄）馬鈴薯M病毒、馬鈴薯S病毒基本信息 分類 馬鈴薯M病毒 potato virus M簡稱PVM。PVM強(qiáng)株系侵染后，馬鈴薯幼苗期小葉片表面有油脂狀光澤，同時小葉迅速開始向下卷曲，葉背出現(xiàn)條斑壞死；隨著馬鈴薯生長發(fā)育，產(chǎn)生明顯花葉，葉片嚴(yán)重變形，并很快黃化至干枯；病株嚴(yán)重萎縮和矮化，其株高只相當(dāng)于健株的1/3高度。 傳播途徑兩種病毒田間通過蚜蟲和農(nóng)事操作進(jìn)行傳播，遠(yuǎn)距離傳播主要通過人為的引種、商品流通等，帶毒塊莖和種苗是該病毒傳播的主要載體。加樣完成后將酶聯(lián)反應(yīng)板置于保濕容器中，室溫孵育2 h或4℃冰箱12 h。25℃避光孵育30 min～60 min,至陽性對照顯色。剩余樣品于20℃冰箱保存?zhèn)洳椋谥茦訒r應(yīng)注意防止樣品的交叉污染。置于保濕容器中室溫孵育2 h。稱取50 mg～100 mg的馬鈴薯葉片或莖桿（薯塊需經(jīng)發(fā)芽后切取幼芽），在液氮中迅速研磨成粉末狀， mL的EP管中，加入500 181。L漂洗液RW，12000 rpm離心1 min，棄廢液，將吸附柱放回收集管中，重復(fù)漂洗一次?！?PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系。EE附 錄 E （資料性附
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