重組水蛭素的聚乙二醇修飾(參考版)
2025-06-25 08:23本頁面
【正文】 聚乙二醇修飾水蛭素的分離純化與活性分析。但也存在不足，如固相修飾法的轉(zhuǎn)化率較低、活化PEG易水解等問題，可嘗試通過不同離子交換填料來進(jìn)行分析研究。 條件下，采用 “離子交換柱輔助”固相修飾的方法對(duì)lys進(jìn)行定點(diǎn)修飾能得到較高比率、純度且較高活性保留率的單修飾產(chǎn)物?；钚员Ａ袈史謩e為55%,96%。采用分子動(dòng)力學(xué)模擬法預(yù)測(cè)：液相修飾的位點(diǎn)有Lys 2Lys 35和Lys 24；Lys35是固相修飾的主要修飾位點(diǎn)。通過對(duì)檢測(cè)修飾產(chǎn)物中SCmPEG與重組水蛭素的偶聯(lián)鍵的檢測(cè)，推斷修飾位點(diǎn)為N末端氨基。液相修飾中得到了以組氨酸位置異構(gòu)體為主的單修飾產(chǎn)物，%, 是微酸性條件下的主要修飾產(chǎn)物，且目的單修飾產(chǎn)物體外抗凝活性保留率為34% 。本文選擇了對(duì)位于非活性中心的His和Lys進(jìn)行修飾。5 討論 目前用于修飾蛋白質(zhì)的活化PEG種類較多,可以根據(jù)蛋白質(zhì)本身的特點(diǎn)和要求選擇不同種類的活化PEG,例如,專一性修飾肽鏈的N端氨基、半胱氨酸的巰基、賴氨酸的側(cè)鏈氨基等[13]。而Lys35位于水蛭素的一個(gè)柔性很大的伸向溶液的環(huán)上，既遠(yuǎn)離水蛭素/凝血酶作用區(qū)，又遠(yuǎn)離水蛭素的N域核心。此種現(xiàn)象從另一個(gè)角度說明固相修飾可以提高修飾專一性。圖12 各種單修飾水蛭素體外比活Fig. 12 The specific activity ratios of the monoPEGylated HV2s in vitro圖12所示，固相修飾的蛋白活力保留率顯著高于液相修飾。這可能是由于固相修飾中，柱內(nèi)填充著的離子交換介質(zhì)導(dǎo)致環(huán)境復(fù)雜，蛋白和PEG在水溶液中狀態(tài)以及分子大小差異使得它們?cè)谥械姆峙洳煌?，致使反?yīng)物接觸幾率降低。相比液相分離在純度及修飾專一性上都有了顯著提高。圖10中峰1，2分別為SCmPEG 20kDa二修飾和單修飾產(chǎn)物。 “離子交換柱輔助”的固相修飾產(chǎn)物的分離純化對(duì)用“離子交換柱輔助”的固相修飾方法得到產(chǎn)物，采用階段洗脫的策略進(jìn)行分離、SDSPAGE法進(jìn)行組分鑒定。圖8 SCmPEG 20kDa液相修飾產(chǎn)物離子交換色譜圖Fig. 8 Ion Exchange Chromatography of the SCmPEG 20kDa HV 2 prepared in solution phase 圖9 SCmPEG 20kDa液相修飾產(chǎn)物離子交換洗脫物電泳圖 SDSPAGE of peaks collected from 結(jié)合表圖9可知，圖8中峰 1, 2分別為二修飾和單修飾產(chǎn)物。該修飾產(chǎn)物的活性保留率略高于液相修飾反應(yīng)所得單修飾產(chǎn)物的活性（34%），,%的單修飾產(chǎn)物的修飾位點(diǎn)為組氨酸殘基，而相同反應(yīng)條件下的固相輔助修飾的單修飾產(chǎn)物的修飾均未發(fā)生在組氨酸，這是兩種單修飾產(chǎn)物活性差異的主要原因。 采用凝血酶滴定法對(duì)修飾產(chǎn)物進(jìn)行活性檢測(cè)。圖7 固相輔助單修飾產(chǎn)物高效凝膠過濾圖譜Fig. 7 HPSEC analysis of the monoPEGylated product of the solidphase assisted PEGylation由圖7可知，中性羥胺作用未能打開mPEG與重組水蛭素之間的連接鍵，所以修飾反應(yīng)未發(fā)生在His51。圖5 固相修飾反應(yīng)混合物（ 20mM PBS, rHir: SCmPEG=1:3）的分離純化Fig. 5 Separation of the solidphase assisted PEGylation reaction mixture ( 20mM , rHir: SCmPEG=1:3 )圖6 固相修飾反應(yīng)混合物( 20mM PBS,rHir:SCmPEG=1:3)的純化產(chǎn)物的電 泳圖譜Fig. 6 SDSPAGE analysis of the separation products of the solidphase assisted PEGylation reaction mixture ( 20mM PBS, rHir: SCmPEG=1:3 )如圖5所示，峰1為鹽濃度突然增大造成的紫外吸收的波動(dòng)，峰2經(jīng)電泳檢測(cè),如圖6所示，分子量為約27KDa，推斷為單修飾產(chǎn)物，峰3經(jīng)高效凝膠過濾檢測(cè)，因其具有和標(biāo)準(zhǔn)重組水蛭素相同的洗脫體積，推斷其為未反應(yīng)的水蛭素。圖4 組氨酸修飾位置異構(gòu)體含量測(cè)定Fig. 4 The proportion assay of Hispegylated positional isomer圖4中，%被中性羥胺斷開為rHirdin, %， PBS中修飾反應(yīng)的主要的成份。峰2具有較高的抗凝活性保留率，并且是修飾反應(yīng)的主產(chǎn)物（%）,因此被選作本文的目標(biāo)單修飾產(chǎn)物做進(jìn)一步的分析。 單修飾產(chǎn)物的體外抗凝活性測(cè)定采用凝血酶滴定法對(duì)修飾水蛭素進(jìn)行活性檢測(cè)。圖1 陰離子交換色譜分離修飾反應(yīng)混合物（） Separation of the PEGylation mixture (prepared at ) by anionexchange chromatography 圖2 修飾產(chǎn)物的電泳結(jié)果（15%5%）Fig. 2 SDSPAGE analysi
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