重組水蛭素的聚乙二醇修飾-全文預(yù)覽
【正文】 EG修飾的研究。上世紀(jì)70年代以來，人們發(fā)現(xiàn)一些蛋白經(jīng)過PEG修飾后，很多方面的藥用特性大大改善。液、固相單修飾活性保留率為34%、%；%、96%。重組水蛭素的聚乙二醇修飾李雪芹，候蓓蓓，趙軍，田明玉，修志龍*大連理工大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)院 大連 116024摘要：目的 水蛭素因血漿半衰期短而嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用，聚乙二醇修飾能有效地延長其半衰期。結(jié)果 、水蛭素單修飾率都高達(dá)90%以上，但二者的單修飾活性保留率相差較大。然而水蛭素有一些顯著的藥用缺點(diǎn)，如血漿半衰期較短，一般只有60100分鐘，患者需不斷注射才能維持抗凝效果，導(dǎo)致治療成本較高，且重復(fù)注射也會(huì)引起一些不良反應(yīng)[24]。這種對水蛭素修改的方式可以大大提高修飾產(chǎn)物的專一性，但是研究周期性較長且須具備一定的科研條件。本實(shí)驗(yàn)組旨在通過比較不同修飾位點(diǎn)、修飾方法所得單修飾產(chǎn)物的比率、純度及其活性保留率來找到修飾專一性強(qiáng)且活性保留率較高的修飾策略。“填料輔助”的固相修飾，將20mM PBS與rHir: SCmPEG以摩爾比1:3在QSepherose FF介質(zhì)中充分反應(yīng)，反應(yīng)完成后裝柱、梯度洗脫。 “離子交換柱輔助”的固相修飾 4 ml (溶于PBS 20 mM, pH 8 A液）與溶于4 ml 20 mM, pH 8 PBS 中的 SCmPEG先后以1 ml/min的流速上樣于柱中，使二者在柱中充分反應(yīng)后進(jìn)行在線梯度洗脫。 組氨酸修飾產(chǎn)物含量檢測利用SCmPEG與rHir的His殘基之間形成的氨基甲酸酯鍵對于中性羥胺的敏感性測定組氨酸修飾位置異構(gòu)體的含量。通過積分法計(jì)算出圖1中各峰的面積，從而得出出各產(chǎn)物的比例：峰1：峰2：峰3= %：%：%，可見單修飾產(chǎn)物是主要的修飾產(chǎn)物。 His修飾位置異構(gòu)體含量測定利用SCmPEG與rHir的His殘基之間形成的氨基甲酸酯鍵對于中性羥胺的敏感性測定組氨酸修飾位置異構(gòu)體的含量。 His修飾位置異構(gòu)體含量測定利用中性羥胺法對修飾位置異構(gòu)體的含量進(jìn)行檢測。表2 凝血酶滴定法測固相輔助單修飾產(chǎn)物活性Table 2 Analysis of the monoPEGylated product of solidphase assisted PEGylation by thrombin titration method由表2知，單修飾產(chǎn)物的抗凝活性為原蛋白（rHir）%。通過積分法計(jì)算出圖8中各峰的面積，從而得出各產(chǎn)物的比例：峰1:峰2= %:%，可見單修飾產(chǎn)物是主要的修飾產(chǎn)物。通過積分法得出圖10中各產(chǎn)物的比例：峰1：峰2= %：%。 修飾產(chǎn)物體外抗凝活力測定采用凝血酶滴定法對修飾水蛭素進(jìn)行活性檢測。 采用溶劑可及表面積法對水蛭素修飾位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)：在液相修飾中除Lys47外其它三個(gè)賴氨酸的NH2殘基都比較容易被修飾；在固相修飾中，Lys 27， Lys 35比Lys 24， Lys 47更易被修飾，又因?yàn)長ys27位于N域的核心部位，靠近三個(gè)二硫鍵，因此PEG對K27的修飾會(huì)降低水蛭素的活性。所選擇被修飾的基團(tuán)必須是蛋白質(zhì)功能的非必需基團(tuán),否則將導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性下降甚至完全喪失。“填料輔助”的固相修飾中， 20mM PBS, rHir: SCmPEG=1:%。在本實(shí)驗(yàn)條件下，液相修飾和“離子交換柱輔助”%、%。 本實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了修飾反應(yīng)與分離的偶聯(lián)，減少了操作步驟，并且離子交換輔助的固相修飾方法為水蛭素的單修飾開辟了新途徑。藥物生物技術(shù)，2004 ,11 (5) :30205.[7]Haina Qin,ZhiLong Xiu,Dalian Zhang et al. Improved Analytical Methods for Pegylated Hirudin,Chinese J Chen Eng,2007,15(4):586590.[8] Stepaniants S, Izrailev S, and Schulten K. Extraction of lipids from phospholipid membranes by steered molecular dynamics. J. Mol. Model., 1997, 3:473– 475.[9] Vitali J, Martin PD, Malkowski MG et al. J. Biol. Chem., 1992, 267:17670.[10]Markwarkt F, Hirudin as inhibitor of thrombin. In , , editiors, In: Methods in Enzymology, 1th ed., New York: Academic Press, 92432，1957.[11]Wong, S. S. Chemistry of protein conjugation and crosslinking. 1991,CRC Press, Boca Raton, FL.[12]Lee, H., Jang, I. H., Ryu, S. H., and Park, T. G. Nterminal sitespecific monoPEGylation of epidermal growth factor. . 2003,20:818825.[13]RobertsMJ, BentleyMD, Harris JM. Chemistry for peptide and protein pegylation[J].Adv Drug Deliv Rev, 2002, 54(4): 45947.1
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