重組水蛭素的聚乙二醇修飾(文件)
【正文】 圖5 固相修飾反應(yīng)混合物（ 20mM PBS, rHir: SCmPEG=1:3）的分離純化Fig. 5 Separation of the solidphase assisted PEGylation reaction mixture ( 20mM , rHir: SCmPEG=1:3 )圖6 固相修飾反應(yīng)混合物( 20mM PBS,rHir:SCmPEG=1:3)的純化產(chǎn)物的電 泳圖譜Fig. 6 SDSPAGE analysis of the separation products of the solidphase assisted PEGylation reaction mixture ( 20mM PBS, rHir: SCmPEG=1:3 )如圖5所示，峰1為鹽濃度突然增大造成的紫外吸收的波動，峰2經(jīng)電泳檢測,如圖6所示，分子量為約27KDa，推斷為單修飾產(chǎn)物，峰3經(jīng)高效凝膠過濾檢測，因其具有和標準重組水蛭素相同的洗脫體積，推斷其為未反應(yīng)的水蛭素。 采用凝血酶滴定法對修飾產(chǎn)物進行活性檢測。圖8 SCmPEG 20kDa液相修飾產(chǎn)物離子交換色譜圖Fig. 8 Ion Exchange Chromatography of the SCmPEG 20kDa HV 2 prepared in solution phase 圖9 SCmPEG 20kDa液相修飾產(chǎn)物離子交換洗脫物電泳圖 SDSPAGE of peaks collected from 結(jié)合表圖9可知，圖8中峰 1, 2分別為二修飾和單修飾產(chǎn)物。圖10中峰1，2分別為SCmPEG 20kDa二修飾和單修飾產(chǎn)物。這可能是由于固相修飾中，柱內(nèi)填充著的離子交換介質(zhì)導(dǎo)致環(huán)境復(fù)雜，蛋白和PEG在水溶液中狀態(tài)以及分子大小差異使得它們在柱中的分配不同，致使反應(yīng)物接觸幾率降低。此種現(xiàn)象從另一個角度說明固相修飾可以提高修飾專一性。5 討論 目前用于修飾蛋白質(zhì)的活化PEG種類較多,可以根據(jù)蛋白質(zhì)本身的特點和要求選擇不同種類的活化PEG,例如,專一性修飾肽鏈的N端氨基、半胱氨酸的巰基、賴氨酸的側(cè)鏈氨基等[13]。液相修飾中得到了以組氨酸位置異構(gòu)體為主的單修飾產(chǎn)物，%, 是微酸性條件下的主要修飾產(chǎn)物，且目的單修飾產(chǎn)物體外抗凝活性保留率為34% 。采用分子動力學(xué)模擬法預(yù)測：液相修飾的位點有Lys 2Lys 35和Lys 24；Lys35是固相修飾的主要修飾位點。 條件下，采用 “離子交換柱輔助”固相修飾的方法對lys進行定點修飾能得到較高比率、純度且較高活性保留率的單修飾產(chǎn)物。聚乙二醇修飾水蛭素的分離純化與活性分析。但也存在不足，如固相修飾法的轉(zhuǎn)化率較低、活化PEG易水解等問題，可嘗試通過不同離子交換填料來進行分析研究?；钚员Ａ袈史謩e為55%,96%。通過對檢測修飾產(chǎn)物中SCmPEG與重組水蛭素的偶聯(lián)鍵的檢測，推斷修飾位點為N末端氨基。本文選擇了對位于非活性中心的His和Lys進行修飾。而Lys35位于水蛭素的一個柔性很大的伸向溶液的環(huán)上，既遠離水蛭素/凝血酶作用區(qū)，又遠離水蛭素的N域核心。圖12 各種單修飾水蛭素體外比活Fig. 12 The specific activity ratios of the monoPEGylated HV2s in vitro圖12所示，固相修飾的蛋白活力保留率顯著高于液相修飾。相比液相分離在純度及修飾專一性上都有了顯著提高。 “離子交換柱輔助”的固相修飾產(chǎn)物的分離純化對用“離子交換柱輔助”的固相修飾方法得到產(chǎn)物，采用階段洗脫的策略進行分離、SDSPAGE法進行組分鑒定。該修飾產(chǎn)物的活性保留率略高于液相修飾反應(yīng)所得單修飾產(chǎn)物的活性（34%），,%的單修飾產(chǎn)物的修飾位點為組氨酸殘基，而相同反應(yīng)條件下的固相輔助修飾的單修飾產(chǎn)物的修飾均未發(fā)生在組氨酸，這是兩種單修飾產(chǎn)物活性差異的主要原因。圖7 固相輔助單修飾產(chǎn)物高效凝膠過濾圖譜Fig. 7 HPSEC analysis of the monoPEGylated product of the solidphase assisted PEGylation由圖7可知，中性羥胺作用未能打開mPEG與重組水蛭素之間的連接鍵，所以修飾反應(yīng)未發(fā)生在His51。圖4 組氨酸修飾位置異構(gòu)體含量測定Fig. 4 The proportion assay of Hispegylated positional isomer圖4中，%被中性羥胺斷開為rHirdin, %， PBS中修飾反應(yīng)的主要的成份。 單修飾產(chǎn)物的體外抗凝活性測定采用凝血酶滴定法對修飾水蛭素進行活性檢測。 Lys修飾位點預(yù)測采用溶劑可及表面積作為判定賴氨酸殘基修飾可能性的判斷標準，運用分子動力學(xué)模擬的方法分析和預(yù)測液相和固相修飾的位點。3 分析方法 SDS–PAGE參考文獻[8]，15%濃縮膠、4%分離膠，采用含5%。 水蛭素Lys位點的PEG修飾 液相修飾 HV2與SCmPEG20 kDa以摩爾比 1:3 M PBS中，在23℃下反應(yīng)。修飾位點選擇了His和Lys；修飾方法選擇了液相修飾和 “填料輔助”、“離子交換柱輔助”兩種固相修飾方法。國內(nèi)也有關(guān)于水蛭素P
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