手足口病的病原學及實驗室檢測(參考版)
2025-05-29 12:02本頁面
【正文】 ? 所有操作應(yīng)遵守國家相關(guān)法律法規(guī)。 生物安全 ? 操作糞便、腦脊液和血液等臨床標本時要特別注意生物安全，要在 II級生物安全柜中進行標本處理、病毒分離和病毒鑒定，無脊灰疫苗免疫史的人員要進行脊灰疫苗免疫。 生物安全 ? 柯薩奇病毒、?？刹《尽?EV71型和目前分類未定的其他腸道病毒均屬于危害程度第三類的病原微生物。 ? Ct值 。 ? Ct值 ≤。 ? 從試劑盒中取出相應(yīng)的試劑，反應(yīng)液在室溫融化后，瞬時離心，按 n+1配置反應(yīng)體系（ n=樣本數(shù)+1管陽性對照 +1管陰性對照） ? 每次實驗均應(yīng)設(shè)立陽性對照和陰性對照 陰性對照：核酸提取時以滅菌雙蒸水代替標本。 rRTPCR注意事項 ? 模板量可根據(jù)樣本情況自行決定（臨床標本通常使用 5ul模板量），不夠部分以水補足。 ?? ? 操作安全，縮短時間，提高效率。 儀器在線式實時檢測 ， 結(jié)果直觀 ， 避免人為判斷 。 ?? ? 用途廣泛 ， 既能定量又能定性 。 操作簡單 ， 高度自動化 。 Realtime RTPCR （ rRTPCR） 與普通 PCR模式相比 ,實時熒光 PCR具備幾個方面的 優(yōu)勢 :?? ? 封閉反應(yīng) ， 污染機會少 。 ? 減少每次處理樣品的數(shù)量； ? 將除了核酸之外的其他試劑先加到反應(yīng)管中，最后再加入核酸； ? 加入一個核酸后要蓋上蓋子，然后再加入其它核酸； ? 使用陽性對照；選取一個穩(wěn)定的每次都能擴增出結(jié)果的樣品作陽性對照； ? 使用一個已知性質(zhì)的樣品作陰性對照； ? 每次實驗都要用試劑混合物作為空白對照。 ? 肛拭子 /咽拭子標本：咽拭子要在標本保存液中充分攪動，然后在 4℃ 條件下， 10000 rpm離心 20min 。 ? 腸道病毒隱性感染也很常見，所以在評估檢測結(jié)果時就要小心一些 中和試驗結(jié)果判定 ? 如果恢復(fù)期血清較急性期血清 EV71或 CVA16中和抗體滴度出現(xiàn) 4倍或 4倍以上增高即可確診； ? 如果恢復(fù)期血清較急性期血清其它腸道病毒中和抗體滴度出現(xiàn) 4倍或 4倍以上增高可證實該腸道病毒感染，是否為病因需要其它相關(guān)實驗證實； ? 如果單份血清中和抗體滴度大于 1:256也有診斷意義，血清中和抗體滴度為 1:128判定為可疑陽性。但 CVA16和 EV71在 HEp2細胞中均不繁殖。 ? 但相同滴度的 CVA16和 EV71在 RD細胞中生長的速度不同， EV71的生長速度要快于 CVA16，表現(xiàn)為 EV71感染RD細胞后出現(xiàn) CPE的時間比 CVA16早， EV71接種細胞后出現(xiàn) CPE很快，但 CVA16一般要經(jīng)過 2次以上傳代才出現(xiàn)明顯的 CPE。如果發(fā)現(xiàn)有細菌污染，須用濾器過濾除菌。 ? 腦脊液標本通常直接用于病毒分離 ? 咽拭子標本的處理：按“手足口病標本采集及檢測技術(shù)方案” 咽拭子處理 （病毒分離用） ? 咽拭子要在標本運輸（保存）液中充分攪動（至少 40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，用于病毒分離時，需要凍融一次（防止多次凍融），使細胞破裂，釋放病毒顆粒。 實驗室檢測 ? 病毒分離 ? 測定人雙份血清標本的中和抗體滴度 ? 逆轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈反應(yīng)（ RTPCR） ? Realtime RTPCR （
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