【正文】 生 物 芯 片 基因芯片 蛋白質(zhì)芯片 微流控芯片 蛋白質(zhì)芯片 , 又稱 蛋白質(zhì)陣列 或 蛋白質(zhì)微陣列 ，是指以蛋白質(zhì)分子作為配基 ,將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標(biāo)記了熒光的蛋白質(zhì)或其他它分子與之作用，洗去未結(jié)合的成分，經(jīng)熒光掃描等檢測方式測定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，來分析蛋白之間或蛋白與其它分子之間的相互作用關(guān)系。 ? 同一機(jī)體的不同細(xì)胞中或者是同一細(xì)胞在不同時期、不同條件下，蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量是各不相同的 。分離蛋白質(zhì)有雙向凝膠電泳、免疫沉淀等。 （ 5）蛋白質(zhì)組學(xué) ? 蛋白質(zhì)組學(xué)是連接基因組學(xué)、遺傳學(xué)和生理學(xué)的一門科學(xué)，已成為研究生命科學(xué)各個領(lǐng)域必不可少的方法。 A. 體外合成的 dsRNA分子直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞 B. 構(gòu)建 RNAi載體，細(xì)胞內(nèi)表達(dá) RNAi分子 秀麗新小桿線蟲（ C. elegans） （ 2） RNA干擾技術(shù)（ RNAi） 模式生物 的基因敲除 （ Knock out） 小鼠、酵母、果蠅等生物 的基因敲除 (3) 基因敲除 (knock out)和基因敲入 (knock in)技術(shù) （ 4）生物信息學(xué) ? 生物信息學(xué) ( bioinformatics) 是以生物大分子為研究對象，以計算機(jī)為工具，運(yùn)用數(shù)學(xué)和信息科學(xué)的觀點(diǎn)、理論和方法去研究生命現(xiàn)象、組織和分析呈指數(shù)級增長的生物信息數(shù)據(jù)的一門科學(xué)。 RNAi作為基因沉默的一個工具，已被廣泛用于基因功能研究、基因治療和新藥研究與開發(fā)等方面。它是轉(zhuǎn)錄后基因沉默（ PTGS）的一種，在生物界中廣泛存在。 重組表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞方法： ? 利用脂質(zhì)體融合的 DNA轉(zhuǎn)染 ? DEAE－ 葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染 ? 磷酸鈣和 DNA共沉淀物的轉(zhuǎn)染 ? 電穿孔法 DNA轉(zhuǎn)染 （ 1）轉(zhuǎn)基因技術(shù) 七、研究基因功能的方法 （細(xì)胞中蛋白質(zhì)功能） 1998年， Fire發(fā)現(xiàn)于線蟲研究中。 通過載體 （ vector） 系統(tǒng) ， 將目的基因 cDNA導(dǎo)入細(xì)胞 ，觀察其功能 。 ?纖維狀蛋白 （ fibrous protein） ：具有比較簡單、有規(guī)則的線性結(jié)構(gòu)，呈細(xì)棒或纖維狀，難溶于水和稀鹽溶液，如膠原蛋白、彈性蛋白、絲蛋白和角蛋白等。 設(shè)計目標(biāo) 解決辦法 熱穩(wěn)定性 引入二硫鍵 增加內(nèi)氫鍵數(shù)目 改善內(nèi)疏水堆積 增加表面鹽鍵 對氧化的穩(wěn)定性 把 Cys轉(zhuǎn)換為 Ala或 Ser 把 Met轉(zhuǎn)換為 Gln、 Val、 Ile或 Leu 把 Trp轉(zhuǎn)換為 Phe或 Tyr 對重金屬的穩(wěn)定性 把 Cys轉(zhuǎn)換為 Ala或 Ser 把 Met轉(zhuǎn)換為 Gln、 Val、 Ile或 Leu 替代表面羧基 pH穩(wěn)定性 替換表面荷電基團(tuán) His、 Cys以及 Tyr的置換 內(nèi)離子對的置換 提高酶學(xué)性質(zhì) 專一性的改變 增加逆轉(zhuǎn)數(shù) (turnover number) 改變酸堿度 蛋白質(zhì)設(shè)計的目標(biāo)及解決辦法 定位突變種類 ? 插入 一個或多個氨基酸殘基 ? 刪除 一個或多個氨基酸殘基 ? 替換或取代 一個或多個氨基酸殘基 ? 最大量的定位突變是在體外利用 重組 DNA技術(shù) 或 PCR方法 ? 突變的 加和性原則 根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)分 ? 簡單蛋白質(zhì)（ simple protein） 清蛋白、球蛋白、谷蛋白、谷醇蛋白、組蛋白、魚精蛋白、硬蛋白等 ? 結(jié)合蛋白質(zhì)（ conjugated protein） =蛋白質(zhì)部分 + 非蛋白質(zhì)部分（輔基） 輔基與蛋白質(zhì)一般共價相連，與蛋白質(zhì)功能密切相關(guān)。如果我們想改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)， 必須改變蛋白質(zhì)的序列 。 蛋白質(zhì)分子設(shè)計 是一門新興的研究領(lǐng)域，其本身在不斷地發(fā)展，其內(nèi)容也在不斷地更新。 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的認(rèn)識對蛋白質(zhì)設(shè)計是至關(guān)重要的，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)涉及 一級結(jié)構(gòu) (序列 )及 三維結(jié)構(gòu) 。 質(zhì)譜分析： 目前的質(zhì)譜儀分析技術(shù) ， 已經(jīng)能夠處理分子量較大的蛋白質(zhì) ， 可以定出蛋白質(zhì)的精確分子量 ；可以檢查該蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的各個肽片段 ，推出其 氨基酸序列 。 氨基酸組成： 蛋白質(zhì)以鹽酸水解成游離氨基酸，再分析各種氨基酸的含量。 （七） 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)測定 等電點(diǎn) (pI)： 等電聚焦法 (isoelectric focusing) 極類似膠體電泳 ， 但可測得蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) 。 分子量測定法： 可利用膠體過濾法 、 超高速離心法(ultracentrifugation)、 或膠體電泳法 (gel electrophoresis) 來測定蛋白質(zhì)的原態(tài)分子量； SDS膠體電泳則可測定次體分子量 。利用這個性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性鑒定或定量分析。 這三種氨基酸在近紫外區(qū)280nm 附近有最大光吸收。有些蛋白質(zhì)的變性是可逆的，變性如不超過一定限度，經(jīng)適當(dāng)處理后，可重新變?yōu)樘烊坏鞍住? 蛋白變性的特征： ? 生物活性的喪失－主要特征 ? 側(cè)鏈基團(tuán)的暴露 ? 一些物理化學(xué)性質(zhì)的改變： 溶解度降低、粘度增加、擴(kuò)散系數(shù)降低 ? 生物化學(xué)性質(zhì)的改變：易被蛋白酶水解 蛋白質(zhì)復(fù)性： 當(dāng)變性因素除去以后，變性蛋白質(zhì)又可重新回復(fù)到天然構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為 renaturation。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的 變性 (denaturation)。 丙酮、乙醇 破壞蛋白質(zhì)水膜 Hg2+、 Ag+、 Pb+ 與蛋白質(zhì)中帶負(fù)電基團(tuán)形成不易溶解的鹽 苦味酸、三氯乙酸、目酸、鎢酸等 與蛋白質(zhì)中帶正電荷的基團(tuán)生成不溶性鹽 （四）蛋白質(zhì)的變性 蛋白質(zhì)的性質(zhì)與它們的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。 如加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。一般是在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱?pH或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。 （三） 蛋白質(zhì)的沉淀 加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等電點(diǎn)狀態(tài)或失去水化層，蛋白質(zhì)的膠體溶液就不在穩(wěn)定并將產(chǎn)生沉淀。 ? 蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的 分子量大小 、所帶的電荷和水化作用 有關(guān)。 膠體 性質(zhì) ? 蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)，如布朗運(yùn)動、光散射、電泳、不能透過半透膜及具有吸附能力等。 （ 二 ） 膠體性質(zhì) 蛋白質(zhì)的分子量 1萬 100萬之間，其分子直徑1100nm之間，在膠體顆粒的范圍。 ? 蛋白質(zhì)在等電點(diǎn) pH條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象。在等電點(diǎn)偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動；在等電點(diǎn)偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場中向負(fù)極移動。 ? 在等電點(diǎn)時 (Isoelectric point， pI)， 蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場中不移動。蛋白質(zhì)分子中可解離的基團(tuán)除肽鏈末端的 ?氨基和 ?羧基外，主要還是多肽鏈中氨基酸殘基上的側(cè)鏈基團(tuán)如 ?氨基、 ?羧基、 ?羧基、咪唑基，胍基、酚基、疏基等。這些蛋白質(zhì)在病變時的一個共同特點(diǎn)是，分子中 β 折疊增加，進(jìn)而導(dǎo)致分子聚集，對蛋白水解酶的抗性增大?；颊?部分或者全部的喪失記憶能力和認(rèn)識能力。 PrPc α螺旋 PrPsc β折疊 正常 瘋牛病 單個球狀分子 纖維狀的聚集態(tài) 瘋牛病的 prion蛋白構(gòu)象的改變 正常prion 異常prion 蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病 老年性癡呆 （ AD,Alzheimei39。正常的 PrP富含α 螺旋，稱為 PrPc。 這類疾病包括 ：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。 ? 酶與變構(gòu)劑 、 配體與受體 蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病 蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病 ：若蛋白質(zhì)的折疊發(fā)生錯誤 ， 盡管其一級結(jié)構(gòu)不變 ， 但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變 ， 仍可影響其功能 ， 嚴(yán)重時可導(dǎo)致疾病發(fā)生 。 變構(gòu)效應(yīng) (allosteric effect) ? 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變伴隨其功能的變化 ， 稱為變構(gòu)效應(yīng) 。 血紅蛋白的構(gòu)象變化與結(jié)合氧 肌紅蛋白 (Mb)和血紅蛋白 (Hb)的氧解離曲線 Hb T態(tài)和 R態(tài)互變 Hb氧合與脫氧構(gòu)象轉(zhuǎn)換示意 協(xié)同效應(yīng) (cooperativity) ? 一個寡聚體蛋白質(zhì)的一個亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱為 協(xié)同效應(yīng) 。 ? 作為 T態(tài)的去氧血紅蛋白有專一性的氫鍵和鹽橋起著穩(wěn)定作用 ， 4個亞基的 C末端處于受束縛的狀態(tài) 。氧合 Hb占總 Hb的百分?jǐn)?shù) （ 稱 百分飽和度 ） 隨 O2濃度變化而改變 。 O2 血紅素與氧結(jié)合后 ， 鐵原子半徑變小 ， 就能進(jìn)入卟啉環(huán)的小孔中 ， 繼而引起肽鏈位置的變動 。 Hb分子 近似球形 ，4個亞基占據(jù)相當(dāng)于四面體的四個頂角。 蛋白質(zhì) (或酶 )的別構(gòu)效應(yīng)，在生物體內(nèi)普遍存在，這對物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)和某些生理功能的變化都是十分重要的。蛋白質(zhì)變性時，由于其空間構(gòu)象被破壞，故引起功能活性喪失，變性蛋白質(zhì)在復(fù)性后，構(gòu)象復(fù)原，活性即能恢復(fù)。 鐮刀狀細(xì)胞貧血病 血紅蛋白分子病 地中海貧血 產(chǎn)生原因： ? 缺失一個或多個編碼血紅蛋白鏈的基因； ? 一個或多個基因無義突變－縮短的蛋白鏈；發(fā)生移碼突變－不能合成正確的多肽鏈； ? 編碼區(qū)外突變－轉(zhuǎn)錄阻斷或 mRNA不能正確加工。 與血紅蛋白相關(guān)的分子病 鐮刀狀細(xì)胞貧血病 血紅蛋白 ?或 ?鏈突變 地中海貧血 血紅蛋白 ?或 ?鏈缺失 被稱之為 “ 分子病 ” 的 鐮刀狀細(xì)胞貧血 僅僅是血紅蛋白（ Hb）β亞基 574個氨基酸殘基中，一個氨基酸殘基即 N端的第 6位的谷氨酸被纈氨酸取代，發(fā)生了變異所造成的。在蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)中，參與功能活性部位的殘基或處于特定構(gòu)象關(guān)鍵部位的殘基，即使在整個分子中發(fā)生一個殘基的異常，那么該蛋白質(zhì)的功能也會受到明顯的影響，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。即在進(jìn)化位置上相差愈遠(yuǎn)，其氨基酸序列差別愈大。 同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進(jìn)化 ?同源蛋白質(zhì) ： 在生物體中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)。 在分子進(jìn)化過程中，細(xì)胞色素 C分子中保持氨基酸殘基不變的區(qū)域稱為 保守部位 。 ? 對不同生物的細(xì)胞色素 C的一級結(jié)構(gòu)分析表明，大約有 28個氨基酸殘基是各種生物共有的，表明這些氨基酸殘基是規(guī)定細(xì)胞色素 C的生物功能所必需的。在生物氧化時，細(xì)胞色素 C在呼