蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能(1)(參考版)
2025-05-03 12:07本頁面
【正文】 Pr變性、沉淀和凝固的定義及彼此之間的關(guān)系。 Pr的一、二、三和四級結(jié)構(gòu)，分別指出 維持它們結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵。 方法 倒推法 順序測定法 倒推法： 組織 Pr、 DNA mRNA cDNA 測定并識讀 cDNA序列 分析 AA組成，推知 Pr一級結(jié)構(gòu) 逆轉(zhuǎn)錄酶 蛋白質(zhì)（ 純 ） 測定分子量，估計 AA殘基數(shù)（除 120） 氨基酸自動分析儀 測定 AA數(shù)量、種類和比例 肽鏈拆開 次級鍵：用 8mol/L脲 或 6mol/L 鹽酸胍 二硫鍵：過甲酸；巰基乙醇；1， 4－二硫代蘇糖醇 肽鏈末端分析 N端： 二硝基氟苯； 丹磺酰氯法 C端： 肼解法 ；羧肽酶法 肽鏈選擇性裂解 化學(xué)法： 溴化氰裂解 ；羥胺法 酶解法：胃蛋白酶、 胰蛋白酶 、糜蛋 白酶、木瓜蛋白酶等 肽段分離 凝膠過濾 離子交換層析 氨基酸順序分析： Edman法 （ 異硫氰酸苯降解法 ）；酶解法 多肽鏈中氨基酸序列分析 的 主要步驟 純度、 Mw和 pI測定 層析法： 凝膠過濾 。 蛋白質(zhì)濃度 mg/ml＝ ?考馬斯亮藍(lán)法（ Bradford法） 三、 多肽鏈中氨基酸順序分析 —— 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定 基本要求 : （ 97%以上）； Pr的分子量 Pr亞基數(shù)目； Pr分子的 AA組成；計算每種 AA 的 個數(shù)。靈敏度較高 25?g250?g/ml. 考馬斯亮藍(lán) G250是一種帶有負(fù)電荷的染料，在酸性條件下可與 Pr上的正電荷結(jié)合，形成藍(lán)色化物，在 595nm具有特定吸收 。 ?超速離心也可用來測定 Pr的分子量 ， Pr的分子量與其沉降系數(shù) S成正比 。 應(yīng)用： ； ； 3. 超濾 利用壓力或離心力強(qiáng)行使水和小分子雜 質(zhì)通過超濾膜除去， Pr留在膜上而稱之。 Pr溶液置半透膜袋中，置流動溶劑（如蒸餾水）中，使小分子雜質(zhì)（如無機(jī)鹽、單糖、雙糖、 AA、小肽等透出）蛋白質(zhì)留于袋中而得到分離。用不同濃度的陽離子洗脫液，如 NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，通過 Na+的離子交換作用，可以將帶有不同正電荷的 Pr進(jìn)行分離。 離子交換層析法 定義 : 利用離子交換樹脂作為支持物，將帶有不同 電荷的 Pr進(jìn)行分離的方法。 注意 ： 防止 Pr在分離過程中發(fā)生變性： ① 0－ 4 ℃ 下 進(jìn)行； ② 有機(jī)溶劑濃度不能太高 ， Pr沉淀后立即分離 2. 有機(jī)溶劑沉淀法： （三）層析（ chromatography) 定義 ： 利用混合物中各組分理化性質(zhì)的差異 ， 在相互接觸的兩相 （ 固定相與流動相 ） 之間的分布不同而進(jìn)行分離分析的技術(shù)方法 。 缺點(diǎn) ：
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