【正文】 ? 谷胱甘肽是由 3種氨基酸通過肽鍵連接而成，這 3種氨基酸分別是 ________、 ________和 ________ ? 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的類型有 ________、 ________、________和 ________ ? 問答：蛋白質(zhì)功能有哪些？ 。 ? ? 原理 ： 先把待提純的某一蛋白質(zhì)的特異 配基 ，通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng) 共價(jià) 的連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面的 功能基上， 在配基與多糖基質(zhì)間遷入一個(gè)連接臂使配基于凝膠之間保持足夠的距離，不致因載體表面的空間位阻而妨礙待分離的大分子與其配基的結(jié)合。 凝膠電泳法： （四）根據(jù)配基特異性的分離純化方法 ? 親和層析 是利用蛋白質(zhì)分子對(duì)其配體分子特有的識(shí)別能力，也即生物學(xué)親和力建立起來的一種有效的純化分離方法． ? 常用的生物親和關(guān)系有： 底物 。 *等電聚焦電泳 ，通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。 根據(jù)支撐物的不同 ， 可分為薄膜電泳 、 凝膠電泳等 。 目 錄 （三）根據(jù)電離性質(zhì)不同的分離純化方法 蛋白質(zhì)在高于或低于其 pI的溶液中為帶電的顆粒 ， 在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng) 。 蛋白質(zhì)分離常用的層析方法 * 離子交換層析： 利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。 * 超濾法 利用正壓或離心力強(qiáng)行使水和小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。 (一 )根據(jù)溶解度不同的分離方法 ? 影響蛋白質(zhì)溶解度的 外部因素 主要有 : ? ① 溶液的 PH值 ②離子強(qiáng)度 ? ③介電常數(shù) ④溫度 ? 內(nèi)部因素 : ? 如氨基酸的組成 ,極性基團(tuán)和非極性基團(tuán)的多少等 陰 極 陽 極 pH=pI pHpI pHpI 帶正電荷 帶負(fù)電荷 凈電荷為零 導(dǎo)電率 溶解度 滲透壓 粘度 達(dá)到最低 ? PH控制 原因 :在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以雙極離子存在，總凈電荷為零 ,顆粒無電荷間的排斥作用 ,易凝集成大顆粒，因而最不穩(wěn)定，溶解度最小，易沉淀析出。 ： 要求把蛋白質(zhì)從原來的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來 ,并保持原來的天然狀態(tài) ,不丟失生物活性 .為此動(dòng)物材料應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織 ,種子材料應(yīng)先去殼去皮 ,然后選擇適當(dāng)?shù)姆椒?,將組織和細(xì)胞破碎以獲得蛋白質(zhì)抽提液 . ： 常用鹽析法、有機(jī)溶劑分級(jí)分離、等電點(diǎn)沉淀法。 蛋白質(zhì)的分離純化與測(cè)定 一、分離純化蛋白質(zhì)的意義 ? 研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能： 要求純度高 ， 不變性； ? 提取活性的酶或蛋白質(zhì)： 必須保持天然活性狀態(tài)； ? 作為藥物或食品添加劑： 純度要求一般。 ③加熱 :制豆腐 ④加重金屬鹽：重金屬鹽（如醋酸鉛）能使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀。鹽析沉淀一般不引起變性。 變性的蛋白質(zhì)容易沉淀，但沉淀的蛋白質(zhì)不一定變性。 ⒉ 雙縮脲反應(yīng) (biuret reaction) 蛋白質(zhì)和多肽分子中 肽鍵 在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)，這是蛋白質(zhì)肽鍵特有的反應(yīng) ,氨基酸并無此反應(yīng) .雙縮脲反應(yīng)可用來檢測(cè)蛋白質(zhì)的定性和定量分析，也可用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的水解程度。 芳香族氨基酸的紫外吸收 （五）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng) ⒈ 茚三酮反應(yīng) (ninhydrin reaction) 在中性條件下蛋白質(zhì)或多肽也能同茚三酮試劑發(fā)生顏色反應(yīng) ， 生成蘭色或紫紅色化合物 。 色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。 天然狀態(tài)，有催化活性 尿素、 β巰基乙醇 去除尿素、 β巰基乙醇 非折疊狀態(tài)，無活性 （四）蛋白質(zhì)的紫外吸收 由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸 ,色氨酸和苯丙氨酸 ， 因此在 280nm波長(zhǎng)處有特征性吸收峰 。 ? 蛋白質(zhì)變性的可逆性： a) 蛋白質(zhì)在體外變性后 ， 絕大多數(shù)情況下是不能復(fù)性的； b) 如變性程度淺 ， 蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象未被嚴(yán)重破壞；或者蛋白質(zhì)具有特殊的分子結(jié)構(gòu) ， 并經(jīng)特殊處理則可以復(fù)性 。 ? 變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)改變： ① 物理性質(zhì) ：旋光性改變 ， 溶解度下降 ，沉降率升高 ， 粘度升高 ， 光吸收度增加等； ② 化學(xué)性質(zhì) ：官能團(tuán)反應(yīng)性增加，易被蛋白酶水解。 5. 還原劑： 巰基乙醇 、 半胱氨酸 、 二硫蘇糖醇等還原劑能使 Pr分子中存在的二硫鍵還原 ， 從而改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象 。 這些作用力的改變均導(dǎo)致了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變 ， 從而產(chǎn)生了變性 。 2. 金屬離子： Ca2+、 Mg2+離子是 Pr分子中的組成部分，對(duì)穩(wěn)定 Pr構(gòu)象起著重要作用除去 Ca2+、 Mg2+會(huì)大大地降低 Pr對(duì)熱、酶的穩(wěn)定性；而 Cu2+、 Fe2+、 Hg2+、 Ag+等易與 Pr分子中的 SH形成穩(wěn)定的化合物，而降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。 4. 其它因素： 如高壓、輻射等處理均能導(dǎo)致蛋白的變性 。 蛋白質(zhì)變性的因素 一、物理因素 1. 加熱： 加熱是引起蛋白質(zhì)變性的最常見因素 ， 蛋白質(zhì)熱變性后結(jié)構(gòu)伸展變形 ， 2. 低溫： 低溫處理可導(dǎo)致某些蛋白質(zhì)的變性 ， 例如 L蘇氨酸胱氨酸酶在室溫下穩(wěn)定 ， 但在 0℃ 不穩(wěn)定； 3. 機(jī)械處理： 有些機(jī)械處理如揉捏、攪打等，由于剪切力的作用使蛋白質(zhì)分子伸展，破壞了其中的 α 一螺旋，使蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)發(fā)生改變而導(dǎo)致變性。 * 蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素 水化膜 顆粒表面電荷 + + + + + + + 帶正電荷的蛋白質(zhì) － － － － － － － － 帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) 在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì) 水化膜 + + + + + + + + 帶正電荷的蛋白質(zhì) － － － － － － － － 帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) 不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒 酸 堿 酸 堿 酸 堿 脫水作用 脫水作用 脫水作用 蛋白質(zhì)顆粒的表面電荷和水化膜 (三 ).蛋白質(zhì)的變性、復(fù)性 * 蛋白質(zhì)的變性 (denaturation) 在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的空間構(gòu)象 被破壞（不包括肽鍵的斷裂） ，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其 理化性質(zhì) 改變和 生物活性 的喪失。 ? 當(dāng) pH pI 時(shí)蛋白質(zhì)為陰離子，在電場(chǎng)中可向陽極移動(dòng)；而當(dāng) pH pI 時(shí)蛋白質(zhì)作為陽離子，在電場(chǎng)中向陰極移動(dòng)。在一定條件下，這些基團(tuán)解離為帶電基團(tuán)，從而是蛋白質(zhì)帶電，所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量與可解離基團(tuán)有關(guān)，也與溶液的 pH值有關(guān)。 PrPc α螺旋 PrPsc β折疊 正常 瘋牛病 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化 The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein 一 .蛋白質(zhì)分子的大小、形狀及分子量測(cè)定 ? 1. 一般分子量為 10 4 106 ,通常分子量低于 1萬為多肽，而高于 1萬為蛋白質(zhì) . ? 細(xì)胞色素 C為 12398 , α 淀粉酶為97600 ，脲酶為 483000，煙草花葉病毒蛋白為 40ⅹ 106。 正常的 PrP富含 α螺旋，稱為 PrPc。 這類疾病包括 ：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。 （三）蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病 蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病 ：若蛋白質(zhì)的折疊發(fā)生錯(cuò)誤 ， 盡管其一級(jí)結(jié)構(gòu)不變 ， 但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變 ， 仍可影響其功能 ， 嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致疾病發(fā)生 。 如果是促進(jìn)作用則稱為 正協(xié)同效應(yīng) (positive cooperativity) 如果是抑制作用則稱為 負(fù)協(xié)同效應(yīng) (negative cooperativ