【正文】 （一）改進的 Sanger法 133 水解肽鏈的方法及特征 裂解劑 裂解位點 胰蛋白酶 Lys、 Arg（ C） 胰凝乳蛋白酶 Phe、 Tyr、 Trp（ C） 彈性蛋白酶 Ala、 Gly、 Ser、 Val（ C） 胃蛋白酶 Phe、 Trp、 Tyr（ N） 溴化氰 Met（ C） 羥胺 Asn— Gly 134 通過核酸推演的方法 按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列 分離編碼蛋白質的基因 測定 DNA序列 排列出 mRNA序列 。 ?應用：蛋白質的分離純化和測分子量。 ?S與蛋白質的密度和形狀有關。 *蛋白質在離心場中的行為用 沉降系數(shù)(sedimentation coefficient, S)表示 ,沉降系數(shù)與蛋白質的密度和形狀相關 。 126 127 128 （五）超速離心 ?超速離心法 (ultracentrifugation) 不同蛋白質的密度與形態(tài)各不相同 ， 在離心力場中沉降的速度也不同 ， 從而將其分離 。 125 蛋白質分離常用的層析方法 * 離子交換層析： 利用各蛋白質的電荷量及性質不同進行分離。 *雙向凝膠電泳： 是蛋白質組學研究的重要技術。 幾種重要的蛋白質電泳 *SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 ：常用于蛋白質分子量的測定。 由于不同的蛋白質帶電多少 、 分子量大小及分子形狀不同 ， 因此在電場中泳動的速度就不同 ， 從而可將蛋白質分離開來 。 122 （三）電泳 蛋白質在高于或低于其 pI的溶液中為帶電的顆粒 ， 在電場中能向正極或負極移動 。 除了丙酮以外 ， 也可用乙醇沉淀 。 121 （二）丙酮沉淀、鹽析 *使用 丙酮沉淀 時 ， 必須在 0～ 4℃ 低溫下進行 ，丙酮用量一般 10倍于蛋白質溶液體積 。 應用：除鹽和濃縮 119 120 ? 超濾法 ：應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的。將蛋白溶液裝入用半透膜制成的透析袋中，可將蛋白質溶液中的小分子化合物除去，這種方法叫透析。生成藍紫色化合物 ⒉ 雙縮脲反應 (biuret reaction) 蛋白質和多肽分子中 肽鍵 在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反應，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質水解程度。 蛋白質的 OD280與其濃度呈正比關系 ， 因此可作蛋白質定量測定 。如再加熱則絮狀物可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中，這種現(xiàn)象稱為蛋白質的凝固作用。 ? 變性與沉淀的關系： ? 變性的蛋白質易于沉淀，有時蛋白質發(fā)生沉淀，但并不變性。 不可逆變性 復性 (renaturation) 111 天然狀態(tài)，有催化活性 尿素、 β巰基乙醇 去除尿素、 β巰基乙醇 非折疊狀態(tài)，無活性 112 * 蛋白質沉淀 維持蛋白質膠體系統(tǒng) 穩(wěn)定性的因素被破壞 ， 蛋白質就可能產生沉淀 。 ? 蛋白質變性后的性質改變： 溶解度降低 、粘度增加、結晶能力消失、生物活性喪失 及 易受蛋白酶水解 。重金屬鹽中毒吃大量乳品或蛋清（生）。 ? 變性的本質： —— 破壞 非共價鍵和二硫鍵 ，不改變蛋白質的一級結構。 * 蛋白質膠體穩(wěn)定的因素 顆粒表面電荷 水化膜 膠體性質：溶于水、 不通透性、布朗運動、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象 107 （三）蛋白質的變性、沉淀和凝固 * 蛋白質的變性 (denaturation) 在某些物理和化學因素作用下，蛋白質分子的特定空間構象被破壞，從而導致其理化性質改變和生物活性的喪失。 105 ? pHpI 帶負電荷 ? pHpI 帶正電荷 ? 體內多數(shù)蛋白 pI為 ， pH為 ， 多數(shù)蛋白帶負電荷。 P rN H 3+C O O HP rN H 3+C O OP rN H 2C O OO HH +O HH +兼 性 離 子p H = p I陽 離 子p H p I陰 離 子p H p I104 蛋白質的等電點 ( isoelectric point, pI) 當?shù)鞍踪|溶液處于某一 pH時 ， 蛋白質解離成正 、 負離子的趨勢相等 ， 即成為兼性離子 ， 凈電荷為零 ， 此時溶液的 pH稱為 蛋白質的等電點 。 PrPc在某種未知蛋白質的作用下可轉變成全為 β折疊的PrPsc，從而致病。 100 瘋牛病 瘋牛病是由朊病毒蛋白 (prion protein, PrP)引起的一組人和動物神經退行性病變。 99 蛋白質構象病的機理： 有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變。 促進作用稱為 正協(xié)同效應 (positive cooperativity) 抑制作用稱為 負協(xié)同效應 (negative cooperativity) 97 變構效應 (allosteric effect) 凡蛋白質 （ 或亞基 ） 因與某小分子物質相互作用而發(fā)生構象變化 ， 導致蛋白質 （ 或亞基 ） 功能的變化 ， 稱為蛋白質的 變構效應 。 所對應的蛋白稱為變構蛋白 ，例如血紅蛋白 、 變構酶 。 （二）血紅蛋白的構象變化與結合氧 93 肌紅蛋白 (Mb)和血紅蛋白 (Hb)的氧解離曲線 94 蛋白質四級結構與功能的關系 —— 變構效應（ allosteric effect） 當血紅蛋白的一個 α亞基與氧分子結合以后 ， 可引起其他亞基的構象發(fā)生改變 ， 對氧的親和力增加 ， 從而導致整個分子的氧結合力迅速增高 ， 使血紅蛋白的氧飽和曲線呈 “ S”形 。 91 （一）肌紅蛋白與血紅蛋白的結構 二、蛋白質空間結構與功能的關系 92 Hb與 Mb一樣能可逆地與 O2結合 ， Hb與 O2結合后稱為 氧合 Hb。 Glu Pro Leu C(146) HbS β 肽鏈 HbA β 肽 鏈 NVal Glu Thr His 蛋白質分子中每條具有完整三級結構的多肽鏈，稱為 亞基 (subunit)（或亞單位）。屬于 超二級結構 。 ~ 77 鹽鍵（離子鍵）： 正負離子間的靜電引力。 C=O…… HOH C=O…… HN 76 疏水鍵 : 疏水基團在水中避開水而聚集在一起的作用力。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位臵。 71 ? 維持蛋白質二級結構的作用力是 ？ ? 肽鍵衍生而來的氫鍵 ? 纖維狀蛋白只有二級結構，例如毛發(fā)與肌肉蛋白 72 ? 電子顯微鏡下的人體頭發(fā) 73 大纖維 鱗狀細胞 皮層細胞 微纖維 微纖維 原纖維 α螺旋 燙發(fā)時 還原劑 加氧化劑形成新的錯位的二硫鍵 好了 74 三、蛋白質的三級結構 非共價鍵： 疏水鍵、離子鍵、氫鍵和 Van der Waals力等 。 與錯誤折疊的肽段結合，誘導其正確折疊。（又稱超二級結構、模序） ? 形式： α α ? ? ? ? α ? 螺旋 轉角 螺旋 68 ??組合 ???組合 ???組合 motif 的常見組合 69 螺旋－環(huán)－螺旋 鋅指 70 （六）分子伴侶（ chaperon） 概念：幫助新生多肽鏈正確折疊的一類蛋白質。 ③ 第二個氨基酸殘基常為 Pro?；卣?。 60 61 62 平行式