生命科學(xué)進(jìn)展ppt課件(參考版)
2025-05-15 12:34本頁(yè)面
【正文】 Brantl, Future Microbiol., 2022 Functions of CisEncoded Base Pairing sRNAs Brantl, Future Microbiol., 2022 作用特點(diǎn) 低濃度，匹配堿基較少時(shí)需要輔助蛋白 Hfq 濃度較高，匹配區(qū)域較長(zhǎng)時(shí)，不需要 Hfq 大部分在環(huán)境變化情況下表達(dá)：離子濃度變化，外膜壓力，營(yíng)養(yǎng)條件變化等等；組成型表達(dá)的比較少 每個(gè) sRNA可調(diào)節(jié)多個(gè)目標(biāo) 。 Ligand blot技術(shù)的 優(yōu)點(diǎn) 1. 操作簡(jiǎn)便，尤其是對(duì)于在變性條件下也能發(fā)生相互作用的蛋白的鑒定和驗(yàn)證； 2. 可鑒定靶蛋白與受體的結(jié)合位點(diǎn)。 3. 以終產(chǎn)物為檢測(cè)對(duì)象，檢測(cè)不到瞬間有相互作用的蛋白質(zhì)； 3. 親和印記， Ligand blot 將 PAGE膠上分離好的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后檢測(cè)哪種蛋白能與標(biāo)記的誘餌蛋白發(fā)生作用，最后通過(guò)顯影或顯色反應(yīng)信號(hào)確定相互作用蛋白，最后通過(guò)質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行鑒定。不能檢測(cè)和分析低表達(dá)量的蛋白之間的相互作用； 2. 假陽(yáng)性。 4. 可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。之后 純化靶蛋白免疫復(fù)合物 ， 凝膠電泳分離后 ， 質(zhì)譜鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白。 ? 原理： 當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。蛋白質(zhì)所帶電荷引起的，并不是生理性的相互作用； 有時(shí)會(huì)檢測(cè)到兩種在細(xì)胞中不可能相遇卻有極強(qiáng)親和力的蛋白。一步純化后與含有目的蛋白質(zhì)的溶液培育，之后利用谷胱甘肽 瓊脂糖 球 珠將融合蛋白 :目的蛋白復(fù)合物沉淀下來(lái)，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳或質(zhì)譜鑒定與誘餌蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)。 1. 谷胱苷肽 S轉(zhuǎn)移酶沉淀試驗(yàn) (GSTpull down) 1988年 smith等利用谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶融合標(biāo)簽從細(xì)菌中一步純化出 GST融合蛋白，從此 GST融合蛋白在蛋白質(zhì)相互作用研究領(lǐng)域里得到了極大的推廣。 噬菌體表面展示缺點(diǎn) 1. 谷胱苷肽 S轉(zhuǎn)移酶沉淀試驗(yàn) (GSTpull down) 三、基于親和層析的蛋白質(zhì)相互作用研究平臺(tái) 2. 免疫共沉淀 (Coimmunoprecipitation) 3. Ligand blot 基本原理是將一種蛋白質(zhì)或抗體固定于某種基質(zhì)上（如 Sepharose，NC膜或 PVDF膜等），當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng)過(guò)改基質(zhì)時(shí)，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒(méi)有吸附的非目標(biāo)蛋白則隨洗脫液流出。 噬菌體表面展示應(yīng)用范圍 ? 應(yīng)用范圍非常廣； ? 可用于高通量篩選； ? 可研究含量很低的與配體特異作用的蛋白質(zhì)； ? 可直接得到相互作用蛋白的編碼序列。 噬菌體表面展示技術(shù)原理 噬菌體表面展示操作流程 構(gòu)建 cDNA文庫(kù)，使外源基因與外殼蛋白基因融合，導(dǎo)入噬菌體 Display Bind to antigen Wash to remove unbound phage Elute Amplify Analyze Detect E
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