【正文】 ? 核酸探針 、 核酸雜交技術(shù) 用于診斷制品的檢驗(yàn) 。 ? PCR擴(kuò)增技術(shù) 用于仔豬大腸菌 K8 K99雙價(jià)基因工程滅活疫苗和仔豬大腸菌 K8 LTB雙價(jià)基因工程活疫苗工程菌的鑒定 。 許多疫苗尤其是 多價(jià)疫苗如馬立克氏病多價(jià)活疫苗的病毒含量測定 （ 蝕斑計(jì)數(shù) ） 和鑒別檢驗(yàn)等也采用單克隆抗體技術(shù) （ 熒光抗體染色技術(shù)或酶聯(lián)免疫染色技術(shù) ） 進(jìn)行 ， 以區(qū)別不同型或亞型的病毒 。 ?其它：膠體金免疫檢測技術(shù)用在雞傳染性法氏囊病診斷試劑的檢測；生物素 — 親和素系統(tǒng)結(jié)合熒光抗體染色技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)用于診斷制品中 。 常用于豬瘟熒光抗體的特異性檢驗(yàn) 、馬立克氏病多價(jià)活疫苗的效價(jià)測定 、 非禽源細(xì)胞（ 或細(xì)胞系 ） 及其制品的外源病毒檢驗(yàn) 。 2. 免疫 — 血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 ?斑點(diǎn)試驗(yàn) （ Dot— ELISA） ：是根據(jù)已知疫病特異性標(biāo)準(zhǔn)陽性血清能與相應(yīng)疫病的斑點(diǎn)酶聯(lián)診斷試劑于硝酸纖維膜等固相材料上發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng) ， 在酶標(biāo)記單克隆抗體和酶底物的參與下 ， 呈現(xiàn)顏色反應(yīng)的原理 ， 用于日本血吸蟲病和馬傳貧 Dot— ELISA診斷試劑的特異性 、 非特異性檢驗(yàn)和效價(jià)測定 。 ELISA試驗(yàn)包括直接法 、 間接法 、 雙抗體夾心法 。 2. 免疫 — 血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 ?對流免疫電泳：用于檢測水貂阿留申病對流免疫電泳抗原與陽性血清的特異性 。 因此在補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中根據(jù)指示系統(tǒng)溶血程度可知反應(yīng)系統(tǒng)中抗原與抗體的關(guān)系 。 ? 細(xì)胞中和試驗(yàn)：主要用于豬偽狂犬 、犬多聯(lián)活疫苗、雞傳染性法氏囊病活疫苗等效力檢驗(yàn)、特異性檢驗(yàn)、抗體效價(jià)測定 及外源病原 檢測。 ? 動(dòng)物中和試驗(yàn)：主要用于牛瘟、豬瘟疫苗、口蹄疫疫苗（乳鼠）等活疫苗的鑒別檢驗(yàn)及其檢驗(yàn)用動(dòng)物的篩選、梭菌疫苗的效力檢驗(yàn)和定型血清效價(jià)測定。 將特異性血清與相應(yīng)疫苗病毒混合，使病毒失去感染宿主的能力（中和）。 2. 免疫 — 血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 ? 中和試驗(yàn) ： 為常用的免疫學(xué)方法，既可定性，又可定量。后者多用于疫苗的抗原含量或相關(guān)診斷試劑的檢驗(yàn)。 ? 間接血凝和反向間接血凝試驗(yàn) ： 間接血凝是將抗原致敏紅細(xì)胞，反 向間接血凝試驗(yàn)是將抗體致敏紅細(xì)胞。主要用于 ND、細(xì)小病毒等活 疫苗的病毒含量測定及活疫苗中污染具有血凝性病毒的檢測。 ?生物學(xué)技術(shù)：微生物培養(yǎng)方法：如無菌檢驗(yàn)、支原體污染的檢驗(yàn)及效力檢驗(yàn)中活菌計(jì)數(shù)或病毒含量測定均采用微生物培養(yǎng)方法，細(xì)菌或支原體培養(yǎng)用適宜培養(yǎng)基進(jìn)行，病毒的培養(yǎng)用雞胚或適宜的細(xì)胞進(jìn)行；動(dòng)物接種方法：如安全檢驗(yàn)用本動(dòng)物或非本動(dòng)物接種方法進(jìn)行。 （二） 獸用生物制品質(zhì)量檢測技術(shù) 、生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 — 血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 物理化學(xué)、生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用 ?物理學(xué)方法：獸用生物制品的檢驗(yàn)大量采用物理學(xué)方法，如物理性狀檢驗(yàn)、真空度測定和水分測定等。 獸用滅活疫苗檢驗(yàn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn) 效力檢驗(yàn)：多用本動(dòng)物進(jìn)行相關(guān)的效力試驗(yàn)（接種 /攻毒或檢測血清抗體），當(dāng)對照組攻毒成立或抗體陰性時(shí)，疫苗免疫組的保護(hù)力或抗體水平須符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。 無菌檢驗(yàn)：不應(yīng)污染細(xì)菌、霉菌；不得含有活的本菌和本毒。 真空度測定：每瓶疫苗均應(yīng)有真空。2）動(dòng)物免疫方法：測定免疫動(dòng)物的血清抗體或免疫攻毒進(jìn)行判定。規(guī)定用多種動(dòng)物進(jìn)行安全檢驗(yàn)的制品，任何一種動(dòng)物結(jié)果不符合規(guī)定者，均判不合格。 鑒別檢驗(yàn)：應(yīng)能被特異抗血清所中和。 純粹檢驗(yàn)：所有制品不應(yīng)污染細(xì)菌、霉菌。通過 SephadexG50柱層析，除去未結(jié)合的游離熒光素，測定熒光抗體染色效價(jià)和蛋白濃度，蛋白濃度不應(yīng)超過 。 標(biāo)記抗體的制備 ? 標(biāo)記抗體技術(shù)主要有熒光抗體技術(shù)、免疫酶組化染色技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、放射免疫測定、免疫膠體金技術(shù)等。作標(biāo)記抗體用血清，免疫球蛋白含量應(yīng)達(dá)到一定的絕對值。采血后 3— 5天再次注射大量抗原，如此循環(huán)進(jìn)行采血及注射抗原。動(dòng)物采血應(yīng)在上午空腹時(shí)進(jìn)行，前一天下午不喂精料，只喂草料及水。 血清采集與提取 ? 最后一次大劑量注射抗原后 8～ 10天進(jìn)行第一次采血。 免疫方法和免疫程序 ? 免疫原注射多采用皮下或肌肉途徑注射，大量抗原注射則以靜脈途徑較好，但抗毒素免疫則不采用靜脈途徑，應(yīng)以背部多點(diǎn)注射為宜。 ? 免疫抗原的制備 制備免疫血清的抗原，多為微生物體或其毒素 (類毒素 )，或其提取物等純化完全抗原。免疫前，須經(jīng)確認(rèn)無傳染病并健康者方可使用。 （二）診斷血清的制備 ? 診斷血清是一類含有特異性抗體、用于診斷或鑒定微生物的生物制劑，包括各種診斷血清、分群血清或分型血清等。有些抗原需要較復(fù)雜的工藝，如變態(tài)反應(yīng)抗原、免疫沉淀試驗(yàn)抗原的制備往往需要提純和濃縮抗原，以增加抗原反應(yīng)的特異性和敏感性。 診斷抗原的制備 ? 基本技術(shù)路線包括：選擇抗原性良好的菌（毒）株 ??? 生產(chǎn)用菌（毒）種的制備與鑒定 ??? 制備細(xì)菌抗原用培養(yǎng)基或制備病毒抗原用細(xì)胞或動(dòng)物等原材料的選擇 ??? 細(xì)菌（固體或液體）的培養(yǎng)或病毒液的繁殖、收獲 ???抗原液的滅活 ??? 抗原的提純、濃縮 ??? 除菌過濾 ??? 抗原的檢驗(yàn) ??? 抗原的分裝與凍干 ??? 保存。由于這種反應(yīng)具有高度的特異性和敏感性，因此臨床上常利用變態(tài)反應(yīng)作為某些傳染病的診斷方法。 ? 5）免疫沉淀試驗(yàn)抗原 當(dāng)可溶性抗原與其相應(yīng)的抗體在溶液中或瓊脂凝膠中擴(kuò)散接觸時(shí)，形成的抗原－抗體復(fù)合物成為肉眼可見的不溶性沉淀物，即為免疫沉淀反應(yīng)。 ? 4）中和試驗(yàn)抗原 中和試驗(yàn)是一種常用的診斷試驗(yàn)方法，既可用于定性試驗(yàn)，又可用于定量試驗(yàn)。根據(jù)指示系統(tǒng)的溶血情況可以間接測定特異性抗原與抗體是否存在及其含量，從而對抗原或抗體進(jìn)行定性或定量。 如果檢驗(yàn)系統(tǒng)中抗原與抗體形成復(fù)合物，則補(bǔ)體被結(jié)合不再游離，隨后加入的指示系統(tǒng)不發(fā)生溶血現(xiàn)象。指示系統(tǒng)包括綿羊紅細(xì)胞、溶血素和補(bǔ)體。 2）補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原 ? 在補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中有兩個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)：即檢驗(yàn)系統(tǒng)和指示系統(tǒng)（溶血系統(tǒng)）。 用紅細(xì)胞作抗原載體的凝集反應(yīng)稱間接血凝試驗(yàn)。直接凝集試驗(yàn)只適用于不產(chǎn)生自凝現(xiàn)象的細(xì)菌，所以應(yīng)用面較窄。參與凝集反應(yīng)的抗原為凝集原，抗體為凝集素。按照診斷試驗(yàn)的種類可將診斷抗原分為凝集反應(yīng)抗原、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)抗原、中和試驗(yàn)抗原、瓊擴(kuò)試驗(yàn)抗原、變態(tài)反應(yīng)抗原及對流免疫電泳抗原等。 三、 獸用診斷試劑的制備 ? 獸用診斷制品中使用的微生物都具有抗原性，根據(jù)抗原與抗體特異性結(jié)合或核酸堿基配對的原理，利用微生物及其代謝產(chǎn)物或動(dòng)物血液及組織材料制成的可用于畜禽疾病診斷的制品稱為診斷用生物制品，包括診斷抗原、診斷血清、標(biāo)記抗體及核酸探針等。 ? 4）新型生物發(fā)酵技術(shù) 傳統(tǒng)的生物發(fā)酵罐變?yōu)樯锓磻?yīng)器，實(shí)現(xiàn)了程序化操作。 ? 2）抗原緩釋技術(shù) 將抗原制成聚合物，增加抗原效能、延長疫苗免疫期。 滅活疫苗 :抗原繁殖、濃縮和純化技術(shù)落后，抗原純度不夠，副反應(yīng)太大；油佐劑滅活苗穩(wěn)定性差，副反應(yīng)大；免疫效果差。 ? 2）液體疫苗保護(hù)劑 甘油 甘油作為保護(hù)劑廣泛用于活疫苗，如 50％甘油鹽水，可以殺滅大多數(shù)細(xì)菌，而病毒卻可存活 二甲基亞砜（ DMSO） 二甲基亞砜可以減少冷凍過程中微小冰晶的形成，因而保護(hù)冷凍的病毒。 疫苗保護(hù)劑 ? 1）凍干疫苗保護(hù)劑（穩(wěn)定劑） 防止疫苗在凍干過程中活性物質(zhì)失去結(jié)構(gòu)水及阻止結(jié)構(gòu)水形成結(jié)晶；保護(hù)微生物中活性物質(zhì)的活性與抗原性；降低細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓差；保持弱毒疫苗中微生物在干燥狀態(tài)下的活力和復(fù)蘇時(shí)迅速恢復(fù)活力；對疫苗的免疫效果無影響；對微生物的保護(hù)性能（尤其是耐熱性能）良好；凍干產(chǎn)品的物理性狀（外觀、色澤、溶解性等）符合要求。 ? 2）凍干苗的配制 按疫苗原液量加入一定比例的保護(hù)（穩(wěn)定）劑，病毒性組織苗需預(yù)先制成乳劑后，加入一定比例的保護(hù)（穩(wěn)定）劑，充分混合后，按規(guī)定頭份定量分裝，分裝過程中應(yīng)隨時(shí)振搖，分裝結(jié)束后迅速進(jìn)行冷凍真空干燥。 ? 2）制苗用病毒液的制備 將一定量的生產(chǎn)毒種接種動(dòng)物、組織、雞胚或細(xì)胞，每天觀察接種動(dòng)物的反應(yīng)，接種雞胚的觀察雞胚的死亡或感染情況，接種細(xì)胞的既可靜止培養(yǎng)，也可轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變，待病毒繁殖充分后收獲含毒器官、組織或含毒細(xì)胞液，收獲的含毒組織或細(xì)胞液。 疫苗原液的繁殖 ? 1）制苗用菌液的制備 液體培養(yǎng)基按培養(yǎng)基量的一定比例接入二級種子菌液，在 37?C左右搖動(dòng)培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)，當(dāng)菌液混濁或 pH下降時(shí)，停止培養(yǎng)，冷卻后收獲菌液或離心后收獲菌泥，適當(dāng)稀釋后置 2— 8?C保存?zhèn)溆?。也可?yīng)用馬血清、大牛血清、綿羊血清或雞、兔血清等。對達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)要求的，將根據(jù)《 獸藥管理?xiàng)l例 》 規(guī)定進(jìn)行處理。 ? 2）試驗(yàn)動(dòng)物 當(dāng)采用動(dòng)物及其動(dòng)物組織生產(chǎn)病毒性活疫苗時(shí)，要求制苗用動(dòng)物應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的來源、品種、品系不同、動(dòng)物級別不同和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，分開飼養(yǎng)，飼喂質(zhì)量合格的全價(jià)飼料。生產(chǎn)禽用疫苗用 SPF雞應(yīng)在隔離環(huán)境中飼養(yǎng)，使用全價(jià)營養(yǎng)的無菌飼料。此外不應(yīng)出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。 ? 2) 綠猴腎 (vero)傳代細(xì)胞檢查法 將中和后的接種 vero細(xì)胞，連傳 2代，不應(yīng)出現(xiàn) CPE，同時(shí)進(jìn)行紅細(xì)胞（豚鼠、雞和人紅細(xì)胞混合物）吸附試驗(yàn)和熒光抗體試驗(yàn)，均應(yīng)為陰性。 3） 外源病毒檢驗(yàn) ? 非禽源種毒 ? 1) 熒光抗體檢查法 先用相應(yīng)的陽性血清中和種毒后，接種細(xì)胞連傳 2代，視被檢的種毒不同，選用不同的細(xì)胞和不同的熒光抗體。 ? 3) 細(xì)胞接種檢查法 將種毒中和后接種 CEF后，培養(yǎng) 5－ 7日，不應(yīng)有特異的細(xì)胞病變（ CPE）產(chǎn)生，并不應(yīng)出現(xiàn)吸附紅細(xì)胞現(xiàn)象。 ? 2) 雞接種檢查法 將種毒接種適宜日齡的 SPF雛雞 20只，點(diǎn)眼、滴鼻接種 10頭份；肌肉注射 100頭份，接種后 21日，重復(fù)接種 1次，第一次接種后 42日采血，測定相關(guān)病原的抗體。 、菌（毒）種的鑒定 ? 2） 毒力返強(qiáng)試驗(yàn) 用基礎(chǔ)菌（毒）種較早代次，按實(shí)際接種途徑大劑量接種各種最易感日齡的靶動(dòng)物，一定時(shí)間后，采集含菌（毒）靶組織制成懸液，再接種另一組易感的靶動(dòng)物，如此至少傳 5代次，觀察每次傳代動(dòng)物的反應(yīng)情況，并比較第一代和最后一代動(dòng)物的反應(yīng)和毒力或致病性增強(qiáng)的趨勢情況。 、菌（毒）種的鑒定 ? 1） 免疫抑制試驗(yàn) 當(dāng)疫苗毒可能存在免疫抑制作用時(shí)，如雞傳染性法氏囊病、豬繁殖與呼吸綜合癥等，應(yīng)對毒種進(jìn)行免疫抑制試驗(yàn)。 ? 4） 基因工程疫苗株的構(gòu)建 利用基因工程技術(shù)改造微生物，構(gòu)建基因工程弱毒活疫苗株。 ? 2） 同屬異種的微生物 選擇與病原同屬不同種，但具有一定的交叉免疫原性，天然宿主不同的微生物株系作為疫苗株，如火雞皰疹病毒預(yù)防雞馬立克氏病，山羊痘細(xì)胞致弱毒株預(yù)防綿羊痘和羊接觸傳染性膿