專題四核酸鑒定技術(shù)(參考版)
2025-05-10 18:17本頁面
【正文】 下一次課內(nèi)容 DNA的高通量測序 OVER! 。 原理： 用化學(xué)試劑處理末端放射性標(biāo)記的 DNA片段，造成堿基的特異性切割。 利用 DNA聚合酶的兩種酶催化反應(yīng)的特性：第一， DNA聚合酶能夠利用單鏈的 DNA為模板，合成出準(zhǔn)確的互補 DNA鏈；第二， DNA聚合酶能夠利用 2’ ， 3’ 雙脫氧核苷三磷酸作底物，使之摻入到寡核苷酸鏈的 3’ 末端，從而終止DNA鏈的延長。 具體操作如下頁圖所示。 DMS化學(xué)干擾的主要局限性是，它只能使 G殘基甲基化。 甲基化干擾實驗（ methyltion interference assay） 根據(jù) DMS（硫酸二甲酯）能夠使 G殘基甲基化，而六氫吡啶又能夠特異切割甲基化的 G殘基這一原理，設(shè)計出了另一種研究 DNA與蛋白質(zhì)相互作用的實驗方法，即甲基化干擾實驗。 而與蛋白結(jié)合的 DNA片段上的 G殘基，不會被 DMS甲基化，從而避開了六氫吡啶的切割作用。如同凝膠阻滯實驗一樣，我們也可以加入非標(biāo)記的競爭 DNA序列，來消除特定的“足跡”，并據(jù)此測定其核苷酸序列的特異性。足跡實驗的一個明顯優(yōu)點是，可以形象地展示出一種特殊的蛋白質(zhì)因子同特定 DNA片段之間的結(jié)合區(qū)域。而 DNaseⅠ 足跡實驗可以解決這個問題。 DNA，可檢測蛋白是否屬于此類轉(zhuǎn)錄因子 DNA的已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點上，引入突變可評估突變對競爭 DNA性能及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的影響。（加入超量的非標(biāo)記競爭 DNA） (a) (b) (c) 在凝膠阻滯實驗中競爭 DNA與探針 DNA之間的競爭作用 （ a）沒有加入競爭 DNA的正常的凝膠阻滯實驗，探針 DNA與特異蛋白質(zhì)結(jié)合，出現(xiàn)阻滯條帶；（ b）加入的超量競爭 DNA與探針 DNA競爭結(jié)合同一種蛋白質(zhì)，阻滯條帶消失；（ c）競爭 DNA與探針 DNA分別結(jié)合不同的蛋白質(zhì)，出現(xiàn)同（ a）一樣的阻滯條帶。 原理： DNA與蛋白的結(jié)合導(dǎo)致了電泳時遷移率的降低。 檢測重組體克隆的菌落雜交技術(shù) 蛋白質(zhì) /DNA、蛋白質(zhì) /RNA雜交技術(shù) 凝膠阻滯實驗（ Gel retardation assay） 又叫 DNA遷移率變動實驗（ DNA mobility shift assay），是在 80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究 DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。 菌落雜交 也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的 DNA同濾膜原位結(jié)合，帶有DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標(biāo)記特異的DNA或 RNA探針雜交。這兩項技術(shù)更適應(yīng)與核酸樣品的定量檢測。 斑點印跡雜交和狹線印跡雜交 斑點印跡雜交（ dot blotting）和狹線印跡雜交（ slot blotting ）是在 Southern印跡雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展的定量化的快速檢測特定核酸（ DNA和 RNA）分子的核酸雜交技術(shù)。由于這種方法與 Southern DNA印跡雜交技術(shù)十分類似，所以叫做 Northern RNA印跡技術(shù)（ Northern blotting）。 在進行核酸印跡轉(zhuǎn)移的時： 80度下烘烤 1～ 2小時； ， DNA分子上的部分胸腺嘧啶殘基同尼龍膜表面的帶正電荷的氨基基團之間進行交聯(lián)。 印跡轉(zhuǎn)移前的凝膠處理： 分子量不同所需轉(zhuǎn)移的時間不同； 浸泡在 HCL溶液中 脫嘌呤 ，再進行 堿變性 堿水解， DNA鏈斷裂 單鏈 （ a） （ b） （ c） （ d） （ e） 基因組 DNA DNA限制片段
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