sds-聚丙烯酰胺凝膠(參考版)
2025-05-10 18:13本頁(yè)面
【正文】 陽(yáng)性反應(yīng)的條帶清晰可辨，并可根據(jù) SDSPAGE時(shí)加入的分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定各組分的分子量。 ? 將印有蛋白條帶的硝酸纖維素膜 (相當(dāng)于包被了抗原的固相載體 )依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。此階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見(jiàn)。 ? 第二階段為電轉(zhuǎn)移。 ? 抗原等蛋白樣品經(jīng) SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯酰胺凝膠中從陰極向陽(yáng)極泳動(dòng)，分子量越小，泳動(dòng)速度越快。這種技術(shù)的作用是對(duì)非放射性標(biāo)記蛋白組成的復(fù)雜混合物中的某些特異蛋白進(jìn)行鑒別和鑒定。 ? (5)偏斜現(xiàn)象 電極放置不平行引起或加樣位置偏斜而引起 (6)帶太寬 加樣量太多或加樣孔泄漏引起 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移 ? 蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠電泳分離后所得的區(qū)帶通過(guò)另一次電泳 ? 轉(zhuǎn)移到特定的固相支持物 (常用硝酸纖維膜 )上 ,稱(chēng)為轉(zhuǎn)移 ? 電泳 . ? 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移并固定特定的固相支持物上 ,然后一特定的 ? 親和反應(yīng)、免疫反應(yīng)或結(jié)合反應(yīng)以及顯色系統(tǒng)分析此印跡 , ? 稱(chēng)為 Western印跡法 (Western Blot). ? 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移步驟 : ? . . 硝酸纖維膜 ? 重氮芐氨基甲基膜上 ? *固相載體 :用于吸附生物大分子物質(zhì)的固體材料 . ? 固相載體與蛋白質(zhì)結(jié)合方式 : ? (1)硝酸纖維膜 :非共價(jià)吸附 ? (2)重氮芐氨基甲基膜 :共價(jià)結(jié)合 ? Western印跡 : 鑒定蛋白質(zhì) 。 （ 2） “ 皺眉 ” 現(xiàn)象 由于垂直電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當(dāng) 凝膠和玻璃板組成的 “ 三明治 ” 底部有氣泡或靠近 隔片的凝膠聚合不完全。 ? ② G250 二甲花青亮藍(lán)，藍(lán)綠色 ? 銀染色 ? 銀染的機(jī)制是將蛋白帶上的硝酸銀（銀離子）還原 ? 成金屬銀，以使銀顆粒沉積在蛋白帶上。 ? ③ 非還原的 SDS處理 許多樣品，如生理體液、血清或尿素，一般只需用1%SDS在 100℃ 煮沸 3分鐘，并不需要加還原劑，此時(shí)二硫鍵不能被斷裂，蛋白并沒(méi)有完全被去折疊 。 ? 三 .去污劑的選擇 無(wú)離子去污劑： Lubro W； Brij35， Tween Triton 陽(yáng)離子去污劑： cetyltrimethyl ammonium bromide （ CTAB） cetylpyyridinium （ CPC） 陰離子去污劑 ： SDS deoxycholate 四 .方法 (1)根據(jù)對(duì)樣品的處理方式的不同
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