基因表達(dá)的檢測(cè)ppt課件(參考版)
2025-05-10 00:16本頁(yè)面
【正文】 導(dǎo)致 PCR產(chǎn)物很少或無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物的原因 凝膠電泳檢測(cè) PCR產(chǎn)物時(shí)，目的擴(kuò)增帶很弱或看不到目的擴(kuò)增帶，應(yīng)從以下幾個(gè)方面尋找原因： 。 RT ? 反應(yīng)程序： 94度 45秒， 58度 45秒， 72度 60秒， 27 CYCLES. Genome: 750 bp cDNA: 250 bp ? 2KB cDNA ZH11 H2O GAL4 ? 反應(yīng)程序： 94度 45秒， 58度 45秒， 72度 60秒， 30 CYCLES. Size : 630 bp 1. Taq酶過(guò)多； 2. Mg2+濃度不合適； 3. 引物濃度過(guò)高或設(shè)計(jì)不合理； 4. 復(fù)性溫度過(guò)低； 5. 循環(huán)次數(shù)過(guò)多； 6. 模板量過(guò)多； PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)拖帶或非特異性擴(kuò)增帶的可能原因： PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè) Optimising the Annealing Temperature ? Primers have a calculated annealing temperature (. 54 ℃ ). ? Temperature must be confirmed practically. ? Temperature steps of 2 ℃ above and below. ? Use gradient cycler. Optimising the Mg2+ Concentration ? The fidelity of the PCR depends on [Mg2+]. ? Optimize [Mg2+] in a ladder of mM. ? Sometimes a promise between yield and specificity. 引物問(wèn)題 引物濃度過(guò)高：與模板錯(cuò)配，非特異擴(kuò)增；產(chǎn)生引物二聚體 引物長(zhǎng)度：一般 18－ 28 bp； GC含量約 50－ 60％ 配對(duì)引物的 Tm值要相當(dāng) 引物 3’端應(yīng)盡量避免互補(bǔ)，以免產(chǎn)生引物二聚體 引物 3’端 3個(gè)或 3個(gè)以上的 GC，容易結(jié)合到基因組GC豐富區(qū)域，導(dǎo)致錯(cuò)誤擴(kuò)增 1. 點(diǎn)樣或染膠問(wèn)題 2. 反應(yīng)體系中忘記加入某種成分 (無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物 ） 或分裝 mixture時(shí)出了問(wèn)題； 3. 目的片段太大 ， 使用的 DNA Polymerase 無(wú)法擴(kuò)增出目的片段； 4. DNA溶液中或反應(yīng)體系中含有 Taq 酶抑制劑 ， 抑制了 Taq DNA聚合酶的活性 。 循環(huán)條件的設(shè)定： Thermal Cyclers ? PCR machine available from many suppliers. ? Many block formats and multiblock systems. ? Reactions in tubes or 96well microtitre plates. 1. 在冰上配制下列反應(yīng)體系 : First strand cDNA 1 ?l TaKaRa Ex Taq (5 u / 1 ?l) ?l 10 Ex Taq buffer 2 ?l dNTP mixture (2 mM) 2 ?l Primer F (10 mM) ?l Primer R (10 mM) ?l ddH2O ?l 混勻后 ， 短暫離心 ， 每管加一滴礦物油 。 ? 循環(huán)次數(shù)： 理論上 20－ 25個(gè)循環(huán) PCR產(chǎn)物的累計(jì)即可達(dá)到最大值 、 實(shí)際操作中 25－ 30較合理 。 ? 延伸： 一般是 70－ 75?C， 此時(shí) Taq DNA聚合酶活性最高 。 可根據(jù)引物的長(zhǎng)度和 G＋ C的含量選擇復(fù)性溫度 。 可根據(jù)模板的復(fù)雜程度調(diào)整變性溫度和時(shí)間 ，一般情況下 94?C 30秒可使各種復(fù)雜的 DNA分子完全變性 （ 過(guò)高的溫度或高溫持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng) ， 可對(duì) Taq DNA聚合酶活性
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