【正文】 其形態(tài)特點(diǎn)。在37℃處理25分鐘左右；終止時(shí)加入lml Carnoy固定液進(jìn)行固定，1000rpm離心8分鐘，去掉上清，指彈離心管底部使細(xì)胞分散，加入10ml Carnoy固定液固定30分鐘，1000rpm離心5分鐘，用吸管輕輕吹打成懸液，取預(yù)冷的載玻片滴一張片，烤干后，Giemsa染色15分鐘左右，水沖洗，干燥后鏡檢。棄去上清，加入2ml有血清的RPMI一1640培養(yǎng)基，同時(shí)用針頭的注射器垂直加入10μg／ml的秋水仙素1滴，輕輕吹打成懸液，37℃水浴中溫育30~60分鐘。在37℃水浴甲靜置5分鐘。 (2)用指彈法彈散細(xì)胞，在37℃ 50％PEG，逐滴加入離心管內(nèi)，并不斷地輕輕搖動(dòng)，整個(gè)過程約90秒鐘。 (1)將上述l、2兩管細(xì)胞倒入一個(gè)離心管中充分混勻。用吸管吹打成單個(gè)懸浮細(xì)胞備用。％的胰蛋白酶消化2～3分鐘，棄去胰酶消化液。將含有M期細(xì)胞的培養(yǎng)基移入離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清加人5ml Hanks液，用吸管吹打成細(xì)胞懸液。 二、方法 1．收集培養(yǎng)的M期HeLa細(xì)胞 取一瓶處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，向培養(yǎng)基中加入10μg／／ml，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，使大量生長(zhǎng)的細(xì)胞被阻斷于M期。形成的這種染色體稱提前凝集的染色體(Prematurely Condensed Chromosome，PCC)。 七十年代初，由于發(fā)現(xiàn)M期細(xì)胞內(nèi)有某種促進(jìn)染色體凝集因子，它無種屬特異性，所以在細(xì)胞融合和染色體技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立了制備染色體提前凝集標(biāo)本的方法。 三、試劑 50％PEG、Hanks液()、RPMI一1640培養(yǎng)基(含10％滅活小牛血清，)10μg／ml秋水仙素，／L KCl低滲液、2％檸檬酸鈉溶液、％次甲基蘭染液、1／15mol／L PBS、Carnoy固定液、Giemsa染液。2．你測(cè)定的細(xì)胞融合率為多少?(張之曾編)實(shí)驗(yàn)十二 應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)制備染色體提前凝集標(biāo)本【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹? 通過細(xì)胞融合技術(shù)，初步了解染色體提前凝集標(biāo)本制備原理、方法及間期細(xì)胞三種時(shí)相的提前凝集染色體特點(diǎn)。 四、融合率的計(jì)算 在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞(包括融合的與未融合的細(xì)胞)，以融合細(xì)胞(含兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞核的細(xì)胞)的細(xì)胞核數(shù)除以總細(xì)胞核數(shù)(包括融合與未融合的細(xì)胞核)即得出融合率。 三、結(jié)果觀察 在高倍鏡下可以看到有兩個(gè)或兩個(gè)以上的雞紅細(xì)胞膜融合在一起，形成一個(gè)異核體細(xì)胞。 (5)緩慢滴加9ml Hanks液以終止PEG的作用，在37℃水浴內(nèi)靜置5分鐘。待PEG全部加入后靜置1分鐘左右。 (3)取上述10％的雞紅細(xì)胞懸液1ml放入離心管中，再加入5ml Hanks液混勻，然后以1,000rpm離心5分鐘，小心棄去上清，用指彈法將細(xì)胞團(tuán)塊彈散。 (2)(MW=4,000)放入試管內(nèi)，在酒精燈上融化之，％的PEG溶液。PEG的促融機(jī)制尚不完全清楚，它可能引起細(xì)胞膜中磷脂的酰鍵及極性基團(tuán)發(fā)生結(jié)構(gòu)重排。 細(xì)胞融合的誘導(dǎo)物種類很多．常用的主要有滅活的仙臺(tái)病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和電脈沖。人工誘導(dǎo)的細(xì)胞融合，在六十年代作為一門新興技術(shù)而發(fā)展起來。(王明武編)實(shí)驗(yàn)十一 細(xì) 胞 融 合【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆占?xì)胞融合原理、應(yīng)用PEG融合細(xì)胞的方法以及細(xì)胞融合率的計(jì)算。圖15—1 各組染色體基本形態(tài)特征的模式圖【作 業(yè)】 一、計(jì)數(shù)HeLa和HL一60細(xì)胞的染色體數(shù)，它們各屬哪種數(shù)目異常? 二、分析制備好的正常人外周血淋巴細(xì)胞染色體，判斷其性別。 余者為C組：C組七對(duì)即第6～12號(hào)14條染色體，按大小順序依次排列，均是亞中著絲點(diǎn)；X染色體被隸屬該組，大小居6～7號(hào)之間，是亞中著絲點(diǎn)。 第四確定F組：F組二對(duì)即第19～20號(hào)4條染色體，染色體比G組稍大、均為中央著絲點(diǎn)。G組二對(duì)即第21～22號(hào)4條染色體，是最小的一組，均為近端著絲點(diǎn)，短臂末端有隨體，長(zhǎng)臂常呈分叉狀，21號(hào)稍小于22號(hào)。 接著確定B組：B組二對(duì)即第4～5號(hào)4條染色體，較大，均為亞中著絲點(diǎn)，兩者不易區(qū)分開。七組染色體的基本形態(tài)特征及分析順序是： A組是七組染色體中最大的一組，首先找出它。通過常規(guī)核型的分析必須掌握三點(diǎn)：(一)會(huì)分組、(二)了解各組染色體的基本形態(tài)特征、(三)會(huì)計(jì)數(shù)數(shù)目和鑒定性別。計(jì)數(shù)時(shí)要把分散的染色體劃分為幾個(gè)區(qū)域以免計(jì)數(shù)重復(fù)或遺漏，然后計(jì)數(shù)并判定性別。在標(biāo)本中選擇一個(gè)染色體之間分散較好，互不重疊的中期分裂相，置于視野中央，然后換油鏡仔細(xì)觀察。 (三)結(jié)果 計(jì)數(shù)HeLa細(xì)胞和HL—60細(xì)胞的染色體數(shù)并尋找是否有畸變的染色體。加入少許低滲液將細(xì)胞從瓶壁洗脫，移入10ml離心管，加入預(yù)熱37℃的低滲液至5 ~ 6ml，在37℃處理25分鐘。 :2傳代進(jìn)行培養(yǎng)，／ml的秋水仙素處理3小時(shí)。 (二)操作 l． 105個(gè)／ml細(xì)胞濃度將FL—60細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，／，移入10ml離心管。 2．?dāng)?shù)目異常 由于腫瘤細(xì)胞分裂失去應(yīng)有的調(diào)控，可出現(xiàn)亞二倍體、超二倍體和多一倍體數(shù)目異?，F(xiàn)象。 三、腫瘤細(xì)胞的染色體標(biāo)本制備 (一)原理 利用腫瘤細(xì)胞無限繁殖的特點(diǎn)，掌握其體外生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞便可獲得豐富的分裂相。 油鏡下觀察可見每一條染色體都含有兩條染色單體，兩條單體由著絲粒相結(jié)。 6．將標(biāo)本面朝下放在染色槽中，加入染液染10分鐘，自來水沖洗，晾干后觀察。 5．吸取1～2滴懸液，在距載片約15cm高度滴于預(yù)冷的干凈載玻片上，迅速對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞吹氣促進(jìn)染色體分散。然后離心，棄上清，重復(fù)固定一次。平衡后以1000rpm離心8分鐘，同樣剩 。再吹打成細(xì)胞懸液，加入預(yù)熱37℃的 ／L的KCL溶液9ml，置37℃水浴中低滲處理30分鐘(這期間配制3:1甲醇一冰醋酸固定液)。 2．按時(shí)終止培養(yǎng)，用吸管溫和吹打成細(xì)胞懸液后，移至10ml離心管中。再結(jié)合離心技術(shù)去掉紅細(xì)胞碎片，然后采用空氣干燥法制片獲得中期染色體標(biāo)本。然后收集細(xì)胞，低滲處理，使細(xì)胞脹大，染色體伸展。每天輕輕震蕩培養(yǎng)瓶二、三次，防止血球沉積并保證血細(xì)胞與培養(yǎng)液充分接觸，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖。每個(gè)培養(yǎng)瓶接種全血O．2ml左右輕輕搖動(dòng)使血和培養(yǎng)液混勻。 2． PHA溶液，封好備用。啟動(dòng)超凈臺(tái)，點(diǎn)燃煤氣燈。 (二)操作 1．打開超凈臺(tái)紫外燈20～30分鐘。各種因素的效應(yīng)(如病毒、電離輻射、化學(xué)藥劑等)也可在淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)條件下進(jìn)行觀察，從而進(jìn)行多種在體內(nèi)無法進(jìn)行的研究。 人體微量全血培養(yǎng)是一種簡(jiǎn)單的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)方法。期不再增殖。 三、試劑 1640培養(yǎng)液、500單位／ml的肝素溶液、10μg／ml的秋水仙素溶液、％％EDTA混合消化液,O．5mg／ml的PHA溶液、／L的KCl溶液，甲醇、冰醋酸、Giemsa原液、磷酸緩沖液()、生理鹽水等。 二、器材和儀器 超凈臺(tái)、煤氣燈、乳膠管、火柴、鑷子、廢液缸、離心機(jī)、水浴箱、定時(shí)鐘、天平、離心管(10m1)、乳頭吸管、顯微鏡、載玻片、平皿等。了解正常及腫瘤細(xì)胞核型的一般特征。 二、繪制馬蛔蟲受精卵有絲分裂的各期細(xì)胞圖像，并注明結(jié)構(gòu)名稱? 三、小結(jié)有絲分裂與減數(shù)分裂過程的異同點(diǎn)。鏡下精子頭部呈梭形，由細(xì)胞核及頂體共同組成，尾部細(xì)長(zhǎng)呈線狀。 (4)末期Ⅱ(TelophaseⅡ)移到兩極的染色體分別組成新核，新細(xì)胞的核具單倍數(shù)(n)的染色體組，胞質(zhì)再次分裂，這樣，通過減數(shù)分裂每個(gè)初級(jí)精母細(xì)胞就形成了四個(gè)精細(xì)胞。 (2)中期Ⅱ(MetaphaseⅡ)紡錘體再次出現(xiàn)，染色體排列于赤道面。 3．減數(shù)分裂Ⅱ(Meiotic divisison Ⅱ)減數(shù)分裂Ⅱ類似一般的有絲分裂，但從細(xì)胞形態(tài)上看，可見胞體明顯變小，染色體數(shù)目少。(4)末期I(Telophase I移動(dòng)到兩極的染色體，呈聚合狀態(tài)，并解旋，同時(shí)核膜形成，胞質(zhì)也均分為二，即形成兩個(gè)次級(jí)精母細(xì)胞，這時(shí)每個(gè)新核所含染色體的數(shù)目只是原來的一半。(3)后期I(Anaphase I)由于紡錘絲的解聚變短，同源的兩條染色體彼此分開，分別向兩極移動(dòng)。(2)中期I(Metaphase I)核膜和核仁消失，紡錘體形成，雙價(jià)染色體排列于赤道面，著絲點(diǎn)與紡錘絲相連。雙線期(Diplotene stage)染色體縮的更短些，同源染色體開始有彼此分開的趨勢(shì)，但因兩者相互絞纏，有多點(diǎn)交叉，所以這時(shí)的染色體呈現(xiàn)麻花狀。偶線期（zygotene stage）同源染色體開始配對(duì)，同時(shí)出現(xiàn)極化現(xiàn)象，各以一端聚集于細(xì)胞核的一側(cè)，另一端則散開，形成花束狀。 (1)前期I(Prophase I)在減數(shù)分裂中，以前期I最有特征性、核的變化復(fù)雜，依染色體變化，又可分為下列各期：細(xì)線期(Leptotene stage)染色體呈細(xì)長(zhǎng)的絲，稱為染色線。 1．精原細(xì)胞(Spermatogonia) 位于精細(xì)管的游離端，胞體較小，由有絲分裂來增殖，其染色體較粗短、染色較濃。 5．壓片 在染色材料上蓋上蓋玻片，再在蓋玻片上放一塊吸水紙，用大拇指垂直在蓋玻片上適力下壓(壓片時(shí)不要滑動(dòng)蓋片)使精細(xì)管破裂細(xì)胞平展開，吸去溢出的染液，即可觀察。固定后移入70％乙醇中存放于4℃冰箱備用。 2．取材 將采到的雄蟲，用大頭針固定在木板或紙盒上，沿腹部背中線剪開體壁，見消化管背側(cè)的淺黃色結(jié)構(gòu)即是精巢，用鑷子分離出來。 (二)蝗蟲精巢壓片標(biāo)本的制備 l．采集 采集到各期分裂相的標(biāo)本是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，解決這一關(guān)鍵要把握兩點(diǎn)(1)時(shí)間：沈陽地區(qū)采集，一般在8月15至25日為宜；(2)蟲體特征：雄蟲翹膀長(zhǎng)到剛好蓋住腹部一半時(shí)，正好是雄蟲精子發(fā)生的峰季，采集最適。減數(shù)分裂過程中體現(xiàn)了遺傳三定律，所以說減數(shù)分裂在穩(wěn)定種的遺傳性狀和繁殖中均起著重要作用。換高倍鏡仔細(xì)觀察不同分裂時(shí)期的細(xì)胞形態(tài)特征．與動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂特征比較，找出植物細(xì)胞有絲分裂的特點(diǎn)和兩者的區(qū)別。 末期(Telophase)移向兩極的染色體恢復(fù)染色質(zhì)狀態(tài)，核膜、核仁重新出現(xiàn)，最后細(xì)胞膜橫縊，兩個(gè)子細(xì)胞形成。 中期(Metaphase)染色體聚集排列在細(xì)胞的中央形成赤道板，由于細(xì)胞切面不同，此期有側(cè)面觀和極面觀的兩種不同現(xiàn)象，側(cè)面觀染色體排列在細(xì)胞中央，兩極各有一個(gè)中心體，中心體之間的紡錘絲與染色體著絲點(diǎn)相連；極面觀由于染色體平排于赤道面上，六條染色體清晰可數(shù)，此時(shí)的染色體已縱裂為二，但尚未分離。兩個(gè)原核形態(tài)相似不易分辨，核內(nèi)染色質(zhì)分布比較均勻，核膜、核仁清楚，細(xì)胞核附近可見中心粒存在。尋找和觀察處于分裂間期和有絲分裂不同時(shí)期的細(xì)胞形態(tài)變化，并轉(zhuǎn)換高倍鏡仔細(xì)觀察。每個(gè)卵細(xì)胞都包在卵殼之中，卵殼與卵細(xì)胞之間的腔，叫卵殼腔。 馬蛔蟲受精卵細(xì)胞中只有6條染色體，而洋蔥體細(xì)胞的染色體為16條，因?yàn)樗鼈兌季哂腥旧w數(shù)目少的特點(diǎn)，所以便于觀察和分析。 二、細(xì)胞有絲分裂的觀察一馬蛔蟲子宮切片、洋蔥根尖切片 (一)原理 細(xì)胞有絲分裂(Mitosis)的現(xiàn)象是分別由弗勒明(Flemming，1882)在動(dòng)物細(xì)胞和施特拉斯布格(Strasburger，1880)在植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。 蛙紅細(xì)胞體積較大、數(shù)多，而且有核，是觀察無絲分裂的較好材料。 一、動(dòng)物細(xì)胞無絲分裂的觀察一蛙血涂片 (一)原理 無絲分裂不僅是原核生物增殖的方式，而且雷馬克(Remak)于1841年最早在雞胚血細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，因?yàn)榇诉^程沒有出現(xiàn)紡錘絲和染色體的變化，故稱無絲分裂(Ami— tosis)。 三、試劑 Carnoy固定液、70％乙醇、醋酸洋紅染液、45％醋酸、二甲苯。【實(shí)驗(yàn)用品】 一、材料和標(biāo)本 蛙血涂片、馬蛔蟲子宮切片和洋蔥根尖切片、固定的蝗蟲精巢。 2．比較一下分離細(xì)胞核時(shí)涂片①、②、③有什么不同?涂片③在你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中純度如何？2． 描述一下涂片⑤所見結(jié)果。 (二)結(jié)果 油鏡下觀察，顆粒狀的線粒體被詹納斯綠B染成藍(lán)綠色。 2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化鈣液lml，用吸管吹打成懸液，以17000rpm離心20分鐘，將上清吸入另一試管中，留取沉淀物， 0．25mol／／L氯化鈣溶液混勻成懸液(可用牙簽)。 (二)結(jié)果 分別于高倍鏡下觀察三張涂片，描述鏡下所見。 5．／L氯化鈣溶液懸浮沉淀物，以2500rpm離心15分鐘棄上清，將殘留液體用吸管吹打成懸液，滴一滴于干凈的載玻片上，涂片③，自然干燥。 3．剪碎的肝組織倒入勻漿管中，使勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨3～5次，用3層紗布過濾勻漿液于離心管中，然后制備一張涂片①，做好標(biāo)記，自然干燥。 二、細(xì)胞核的分離提取 (一)操作步驟 1．用頸椎脫位的方法處死小白鼠后，迅速剖開腹部取出肝臟，剪成小塊(去除結(jié)締組織)％NaCl的燒杯中，反復(fù)洗滌，盡量除去血污，用濾紙吸去表面的液體。由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心開始時(shí)均勻分布在整個(gè)離心管中，所以每級(jí)離心得到的第一次沈淀必然不是純的最重的顆粒，須經(jīng)反復(fù)懸浮和離心加以純化。 分級(jí)分離(Fractionation)由低速到高速離心逐漸沉降。 分離細(xì)胞器最常用的方法是將組織制成勻漿，在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心法進(jìn)行分離，其過程包括組織細(xì)胞勻漿、分級(jí)分離和分析三步，這種方法已成為研究亞細(xì)胞成分的化學(xué)組成、理化特性及其功能的主要手段。 三、試