細胞生物學(xué)實驗細胞融合(參考版)
2025-01-21 02:30本頁面
【正文】 ? 6. 顯微鏡 (高倍 ) 觀察 2個或 3個靠近細胞融合過程。 ? 1mL到 1個試管中，加入 ～ mL預(yù)熱的 50％ PEG混勻，置于 30℃ 水浴 2min； 再加入 Ringer或 Hanks液 5ml以終止 PEG的作用 。重復(fù)再離心洗滌 1次。1500r／ min離心 5 min。 (2)雞血紅細胞懸液的制備：用注射器吸入 1mLAlsver液后從雞翼下靜脈取血 2mL，注入刻度離心管內(nèi)，按照 3： 1(V／ V)加入 6mL Alsver液混勻。 (4)50％ PEG混合液：稱取少許 PEG(Mw 4000)放人刻度離心管內(nèi)，在沸水浴中加熱， 的等體積的 GKN液，混勻。 ? (2)GKN液：氯化鈉 8 g，氯化鉀 g， 磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉 ，葡萄糖 2 g，酚紅 g，溶于 1000mL重蒸水中。 “ 這完全是對人類尊嚴的褻讀。 這樣的人畜細胞融合會造成什么后果？ 4位專家分析指出： 首先，某些目前未知的兔子疾病將傳染給人類，就像艾滋病病毒可能是從非洲猩猩而來。陽性孔中的細胞還不能保證是來自單個細胞，挑選陽性孔的細胞繼續(xù)進行有限稀釋，一般需進行 3～ 4次，直至確信每個孔中增殖的細胞為單克隆細胞。將雜交瘤細胞稀釋，用多孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖。 5. 雜交瘤細胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？ ? 融合后的細胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細胞就是雜交瘤細胞。我們以制備單克隆抗體為例來說明這一問題。更重要的是，即使兩個細胞已發(fā)生融合，但并不一定是研究者期望得到的細胞類型。 ? 3已成功的動物細胞融合實例還有哪些？ ? 生物種類 細胞來源 成功年代 ? 酵母菌 — 雞 原生質(zhì)體 — 血紅細胞 1975年 ? 人 — 胡蘿卜 腹水癌細胞 — 原生質(zhì)體 1976年 ? 人 — 小鼠 纖維肉瘤細胞 — 畸胎瘤細胞 1978年 進行細胞融合？ ? 就目前常用的細胞融合方法來看，不管是用物理的、化學(xué)的方法，還是生物的方法，其融合率都不可能是 100%。 ? B淋巴細胞具有產(chǎn)生單一抗體的能力，但不能在體外增殖 ? 骨髓瘤細胞是一種癌細胞，它能在體外培養(yǎng)條件下無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體。 ，為什么要選用 B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞？ ? 提示：哺乳動物感染抗原后，其體內(nèi)會形成相應(yīng)的 B淋巴細胞， B淋巴細胞能分泌相應(yīng)的抗體凝聚或殺死這些抗原。植株地上部結(jié)番茄，地下部生長根莖，產(chǎn)量高，品質(zhì)好。如；各種癌癥、肝炎病毒、 SARS病毒、細菌及血吸蟲等數(shù)百種疾病的診斷；在疾病治療方面，單克隆抗體猶如人體衛(wèi)士，能識別 “ 自己 ” 與 “ 異己 ” ，一旦發(fā)現(xiàn) 致病因素便與之結(jié)合將其殺死。 雜交瘤細胞產(chǎn)生 單克隆抗體示意圖 單克隆抗體的應(yīng)用 ? 主要用于疾病的診斷、治療和預(yù)防。及時判斷陽性孔也是一項重要的工作，可起減少工作量和保證重點雜交細胞雙重作用，待集落生長到 96孔板孔 1/3左右， 24孔板 1/5左右，就要及時測定各孔上清中是否會有特異性抗體，一旦發(fā)現(xiàn)抗體陽性孔，就應(yīng)立即擴大培養(yǎng)，再凍存和克隆化，以免被其他細胞生長所壓抑或意外丟失。腹水中單克隆抗體含量可達 520mg/ml，可以將腹水中細胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。 2） 腹水的制備： ? 腹腔注射 1x106雜交瘤細胞，按種細胞 710天后可產(chǎn)生腹水。 ? 5）蓋片分離法 ； 、大小形態(tài)適用的選出； ； ，挑出單細胞玻片； 。如果從免疫動物的脾細胞中除去能形成特異性玫瑰花結(jié)的細胞則失去對特異性抗原的反應(yīng)性。 普通顯微鏡操作法：于 6cm平皿中，假如約 103個細胞； CO2培養(yǎng)基箱中靜置 1小時左右無菌條件；在倒置顯微鏡下去平皿蓋用直角轉(zhuǎn)頭滴管，吸出單個細胞移至預(yù)先加有飼養(yǎng)細胞的 96孔板內(nèi)直至96孔均分裝有細胞，加蓋；于 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)觀察與更換培養(yǎng)方法同有限稀釋法。也可以用溶血空斑技術(shù)或圍繞集落形成免疫沉淀的方法來直接測它的活性。但缺點是克隆率不高。待細胞長成集落后，用毛細管吸出移種于含飼養(yǎng)細胞的 96孔板內(nèi)。 ? 稀釋 ? 1）有限稀釋法 有限稀釋法原理是從理論上將細胞稀釋到 10個/ml，然后裝成每小孔 (96孔板 ) ，使每孔理論上含有單個細胞，經(jīng)過培養(yǎng)后即可獲得單個細胞形成集落 。 ②腹腔細胞能清除培養(yǎng)中的死亡細胞，從而促進單個細胞克隆的生長。 胚胎成纖維細胞因在細胞培養(yǎng)條件下有分裂增殖的能力，故只適應(yīng)于軟瓊脂平板法培養(yǎng)中，該細胞鋪于平板的底層。 ? 注意事項：①待克隆細胞生長處于對數(shù)增長期；②小牛血清的質(zhì)量和濃度；③細胞計數(shù)要準確；④及時觀察細胞生長情況。 ? 克隆化的目的 1） 是細胞建株的必經(jīng)過程，以得到遺傳特征相同的細胞； 2） 就雜交瘤而言，可從中篩選出穩(wěn)定而同源的雜種細胞系，淘汰遺傳不穩(wěn)定的雜交瘤細跑。 ? 在培養(yǎng)過程中，一般要加能釋放某些生長因子促進雜交瘤生長的 飼養(yǎng)細胞 ，如小鼠的腹腔巨噬細胞、脾細胞或胸腺細胞等。常用的方法 有：放射免疫測定、酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫熒光測定。 ? 在 HAT培養(yǎng)基中， HPRT 或 TK 親本細胞死亡，淋巴細胞亦逐漸死亡，只有 雜種細胞存活 。 ? 淋巴細胞具有合成 DNA的兩條途徑。 ? HPRT細胞的嘌呤只能由 全合成途徑 產(chǎn)生； ? TK 細胞的嘧啶只能由 全合成途徑 合成。 ? DNA合成途徑有兩種。 ? 用 HAT選擇性培養(yǎng)時每隔 2－ 3天半量換液，7天后可以選擇出雜交瘤細胞。 ? 融合細胞的早期觀察及其異常結(jié)果分析： ? 1．融合后的細胞早期觀察與管理；2．無分泌特異性抗體雜交瘤原因分析； ? 3．轉(zhuǎn)種與擴大培養(yǎng)過程中雜交瘤細胞生長； ? 4．不出現(xiàn)雜交瘤的原因分折。 ? 在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在 60秒鐘內(nèi)逐滴加入 50%的 PEG ，隨后靜置90秒。 ? 將免疫脾細胞和小鼠骨髓細胞以 2： 1或 10：1的比例混勻于 50ml錐形離心管內(nèi)。 4. 細胞融合劑的選擇：
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