細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)ppt課件(參考版)
2025-05-16 01:19本頁面
【正文】 ? 結(jié)果微絲束呈深藍(lán)色 五 、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞骨架的考馬斯亮蘭染色結(jié)果 洋蔥鱗莖外層與內(nèi)層的內(nèi)表皮細(xì)胞比較（放大倍數(shù) 10 20） 左：鱗莖外層（對照）；右鱗莖內(nèi)層 。 ? 實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵： Triton X100 抽提處理的時(shí)間很關(guān)鍵，如果處理時(shí)間太短，沒有抽提掉細(xì)胞器膜上的蛋白，會造成很深的背景顏色，干擾細(xì)胞骨架的觀察；如果處理時(shí)間太長，會破壞骨架蛋白使骨架纖維斷裂。 （ B） M－緩沖液 : M緩沖液使細(xì)胞骨架中的微絲保持穩(wěn)定，在 M緩沖液中，其中咪唑是緩沖劑， EDTA （乙二胺四乙酸） 和 EGTA （乙二醇雙醚四乙酸） 螯合 Ca2＋， 并提供 Mg2＋ 離子，在低鈣條件下，骨架纖維保持聚合狀態(tài)并且較為舒張，便于觀察。 ? 光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞骨架的形態(tài)學(xué)觀察多用 1％Triton X100處理細(xì)胞，可使細(xì)胞膜溶解，而細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)被保存，再用考馬斯亮蘭 R250染色，使得細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞骨架得以清晰可見。 二、實(shí)驗(yàn)原理 ? 細(xì)胞骨架是指細(xì)胞質(zhì)中縱橫交錯(cuò)的纖維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，按組成成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)的不同可分為微管、微絲和中間纖維。 實(shí)驗(yàn)七 細(xì)胞骨架的觀察 考馬斯亮蘭 R250染植物細(xì)胞的微絲 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? 掌握觀察植物細(xì)胞內(nèi)微絲的方法。 ? 如果分離的顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快，并且每種大小的顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前，最后各種不同大小的顆粒在離心管中被分成獨(dú)立的區(qū)帶。收集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮液，將較小的顆粒沉降，以此類推，達(dá)到分離不同大小顆粒的目的。 差速離心 （ differential centrifugation） ? 主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細(xì)胞器。 ? 線粒體藍(lán)綠色，呈小棒狀或圓形。 線粒體藍(lán)綠色，呈小棒狀或圓形。 ? (2)鑒定 :在干凈的載玻片中央滴加 1～ 2滴中性紅 詹納斯綠染液 ,用牙簽挑取沉淀物均勻涂片 。 ? 3. 分離介質(zhì) 液哪一種在下層 ? 有什么作用 ? ? (1)分離 :將分離細(xì)胞核時(shí)收集的上清液以10000g(12270rpm)離心 10min。 核 DNA呈藍(lán)綠色，核仁和混雜的細(xì)胞質(zhì) RNA呈紅色。 下次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： （ 4）鑒定：將分離純化的細(xì)胞核制成涂片，空氣干燥。棄上清液，沉淀即為經(jīng)過純化的細(xì)胞核，用 PBS溶液懸浮， 4?C保存。盡量使兩種溶液明顯分層。沉淀使用 1ml預(yù)冷的 溶液離心洗滌 2次，每次 1000g(3880rpm)離心10min。第一次以 600g(3005rpm)離心10min。 （ 2）離心：低溫離心機(jī)（ 4℃ ）中進(jìn)行。將燒杯中的懸浮肝組織倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿 ,勻漿過程要在冰浴中進(jìn)行。 四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 ? （ 1）組織勻漿 :將饑餓 24h的大白鼠處死 ,立即剪開腹部 ,迅速取出肝組織浸入預(yù)冷的生理鹽水 ,洗去血污 ,用濾紙吸干。中性紅為弱堿性染料，對液泡系 (即高爾基體 )的染色有專一性，將活細(xì)胞中的液泡系染紅色。 中性紅 詹納斯綠染色 線粒體分析 ：詹納斯綠（ Janus green B）是對線粒體專一的活細(xì)胞染料，毒性很小，屬于堿性染料，解離后帶正電，由電性吸引堆積在線粒體膜上。 活體染料之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是染料的“電化學(xué)”特性起重要作用。核酸是酸性的，它們對于堿性染料甲基綠和派洛寧的親和力不同，而使這兩種染料對兩類核酸具有了選擇性。由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心開始時(shí)均勻分布在整個(gè)離心管中，所以每級離心得到的第一次沉淀必然不是純的最重的顆粒，須經(jīng)反復(fù)懸浮和離心加以純化 . (3)分析 ：分級分離得到的組分，可用細(xì)胞化學(xué)和生化方法進(jìn)行形態(tài)和功能鑒定。 (2)分級分離 (Fractionation)：由低速到高速離心逐漸沉降。 ? 分離細(xì)胞器最常用的方法是將組織制成勻漿，在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心法進(jìn)行分離，其過程包括組織 細(xì)胞勻漿 、 分級分離 和 分析三步，這種方法已成為研究亞細(xì)胞成分的化學(xué)組成、理化特性及其功能的主要手段。根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法來分離不同的細(xì)胞器。利用各種物理方法（研磨、超聲波振蕩、低滲等將組織制成勻漿，細(xì)胞中的個(gè)中亞組分即從細(xì)胞中釋放出來。 五、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ? 在顯微鏡下分別找出凋亡和壞死的細(xì)胞，描述形態(tài)特征。 ? ：按照沉淀物的量加入幾滴固定液，輕輕打勻后滴片并標(biāo)記好，室溫下空氣干燥。 ? ：用新鮮固定液（甲醇 ∶ 冰醋酸 =3∶1 ）預(yù)固定一次，室溫放置 10 min， 1000 rpm離心 5 min收集沉淀。 凋亡 壞死 三、材料和試劑 ? 材料：人類淋巴細(xì)胞株 ? 試劑： mol/L KCl 溶液、甲醇、冰醋酸 、Giemsa染液 四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 ? 細(xì)胞收集：取 1ml細(xì)胞懸液于小離心管中，1000rpm離心 5min，棄上清。壞死細(xì)胞的膜通透性增高，致使細(xì)胞腫脹，細(xì)胞器變形或腫大，早期核無明顯形態(tài)學(xué)變化，最后細(xì)胞破裂。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，就像樹葉或花的自然凋落一樣 。 實(shí)驗(yàn)五 宮頸癌 HeLa細(xì)胞株培養(yǎng) 五、細(xì)胞調(diào)亡和壞死的識別 (選做 ) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? 了解細(xì)胞凋亡和壞死的形態(tài)特征 二、實(shí)驗(yàn)原理 ? 細(xì)胞凋亡 是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。找出計(jì)數(shù)板上的方格，計(jì)算四角大格內(nèi)總的細(xì)胞數(shù)，壓著大格線者只計(jì)左側(cè)或上方，不計(jì)右側(cè)或下方。注意滴液勿有氣泡，也不能太多（約 10ul），否則會使蓋片浮起而是細(xì)胞計(jì)數(shù)不準(zhǔn)。 三、材料和試劑 ? 材料： HeLa細(xì)胞株 ? 試劑： %臺盼藍(lán)溶液（ 生理鹽水配制why？ ） 四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 ? 將細(xì)胞懸液充分混勻后取 20ul放入干凈的離心管中，加入等體積的 %的臺盼藍(lán)染液混合，放置 2min。多種方法可以鑒別細(xì)胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。 六、思考題 ? 如何防止傳代過程的可能污染？ 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? 掌握死活細(xì)胞的鑒別原理及方法。 具體操作： 每兩個(gè)小組共用一個(gè)培養(yǎng)瓶配制 100ml的 生長培養(yǎng)基 每人取 10ml培養(yǎng)基到自己的細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi) 向細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)接種 400ul的 HeLa細(xì)胞株原液 放入二氧化碳培養(yǎng)箱， 旋松瓶蓋 根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量看細(xì)胞瓶是否平放或直立放置 觀察 ? 倒置顯微鏡
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