【正文】 ? 因此，把一種 B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，它會兼有兩個(gè)親本細(xì)胞的特性 ──在體外培養(yǎng)條件下能不斷增殖，同時(shí)能產(chǎn)生出某種特異性的抗體。 ” 精子和卵子受精 肌管 破骨細(xì)胞 是由好幾個(gè) 細(xì)胞 融合 巨 細(xì) 胞 骨巨細(xì)胞瘤 骨巨細(xì)胞瘤 綠色箭頭所指為正在融合的間質(zhì)細(xì)胞 附錄： 蟾蜍血紅細(xì)胞 \雞血紅細(xì)胞 ? [實(shí)驗(yàn)步驟 ] ? ： ? (1)Alsver液：葡萄糖 g，檸檬酸鈉 g，氯化鈉 g，加重蒸水至 100 mL 即可。取血細(xì)胞懸液 1滴滴于載玻片上，再加入 %次甲基藍(lán)溶液 1滴 ,蓋上蓋玻片。該過程即為雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。 動物細(xì)胞融合與單克隆抗體 思考與探究 ? 有什么不同？ 提示：植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動物細(xì)胞融合技術(shù)基本相同，不同的是植物體細(xì)胞融合前需去掉細(xì)胞壁，然后再融合；動物細(xì)胞融合是兩個(gè)體細(xì)胞直接融合。 玫瑰花結(jié)原理：分泌抗體細(xì)胞在其表面含有抗原受體，在 — 定的條件下?？膳c特異性抗原致敏的羊紅細(xì)胞形成玫瑰花結(jié)。 3） 減少非分泌型無關(guān)細(xì)胞生長過快。 三 雜交瘤細(xì)胞的篩選 融 合 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng) HAT 1 2 3 4 HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞 ? 細(xì)胞團(tuán)塊分散后，加 HAT溶液 ，稀釋至骨髓瘤細(xì)胞不超過 2 105 ml，即可加入有飼養(yǎng)細(xì)胞的 96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)每孔 ，如是24孔板，每孔 ；總量分別為 1ml。細(xì)胞的倍增時(shí)間為 1620h。 ? 一般取最后一次加強(qiáng)免疫 3天以后的 脾臟 ，制備成細(xì)胞懸液。 融合時(shí)最適合的離子強(qiáng)度一般為。 原生質(zhì)體電融合過程 1）在高頻電流電場下的相互接觸。 細(xì)胞融合過程中兩個(gè)細(xì)胞膜的變化 形成細(xì)胞橋的具體變化 細(xì)胞融合分為兩種： （ 1）自發(fā)細(xì)胞融合 自發(fā)細(xì)胞融合（ spontaneous cell fusion）是在 未施加任何誘導(dǎo)條件 的情況下所發(fā)生的細(xì)胞融合現(xiàn)象。 自發(fā)細(xì)胞融合現(xiàn)象在自然界中并不多見，常見的主要有以下幾種情況： 1. 精子和卵子受精 2. 肌管的形成 3. 胚胎著床 4. 巨細(xì)胞的形成 5. 破骨細(xì)胞的形成 6. 腫瘤細(xì)胞融合 （ 2）誘導(dǎo)細(xì)胞融合 人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合是在 人為條件下 發(fā)生的細(xì)胞融合現(xiàn)象 常用的誘導(dǎo)方法有三種： 1. 生物法（病毒誘導(dǎo)法等） 2. 化學(xué)法（ PEG誘導(dǎo)法、 Ca 2+誘導(dǎo)法、 溶血卵磷脂誘導(dǎo)法等） 3. 物理法（電誘導(dǎo)法等） 常用的病毒：仙臺病毒（ Sendal virus), 又稱日本血凝病毒 ? （ Hemagglutinating virus of Japan,HVJ） ? 屬于副粘液病毒科， RNA病毒，圓球形 ? 1962年，日本仙臺東北大學(xué)學(xué)者岡田發(fā)現(xiàn)仙臺病毒可誘導(dǎo)細(xì)胞融合。 2）脈沖刺激后 30s 3)50秒后 4） 5） 6分鐘后 6） 15分鐘后，原生質(zhì)體融合完成。 ? ⑥ 最適合的 pH為 ， 在此范圍之外 ， 融合率均較低 。 ? 淋巴細(xì)胞：經(jīng)過免疫處理的淋巴細(xì)胞，多用大鼠或小鼠。 親本細(xì)胞的準(zhǔn)備 骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備 骨髓瘤細(xì)胞：是癌變的漿細(xì)胞，可以分泌免疫球蛋白，所以必須選擇 不分泌免疫球蛋白的缺陷型 骨髓瘤細(xì)胞， 多用 BALB/C 小鼠的骨髓瘤細(xì)胞。 ? 用 HAT選擇性培養(yǎng)時(shí)每隔 2－ 3天半量換液，7天后可以選擇出雜交瘤細(xì)胞。 ? 注意事項(xiàng)：①待克隆細(xì)胞生長處于對數(shù)增長期；②小牛血清的質(zhì)量和濃度；③細(xì)胞計(jì)數(shù)要準(zhǔn)確；④及時(shí)觀察細(xì)胞生長情況。如果從免疫動物的脾細(xì)胞中除去能形成特異性玫瑰花結(jié)的細(xì)胞則失去對特異性抗原的反應(yīng)性。 ，為什么要選用 B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞？ ? 提示：哺乳動物感染抗原后，其體內(nèi)會形成相應(yīng)的 B淋巴細(xì)胞， B淋巴細(xì)胞能分泌相應(yīng)的抗體凝聚或殺死這些抗原。 這樣的人畜細(xì)胞融合會造成什么后果？ 4位專家分析指出： 首先，某些目前未知的兔子疾病將傳染給人類，就像艾滋病病毒可能是從非洲猩猩而來。 ? 6. 顯微鏡 (高倍 ) 觀察 2個(gè)或 3個(gè)靠近細(xì)胞融合過程。 “ 這完全是對人類尊嚴(yán)的褻讀。 ? B淋巴細(xì)胞具有產(chǎn)生單一抗體的能力，但不能在體外增殖 ? 骨髓瘤細(xì)胞是一種癌細(xì)胞，它能在體外培養(yǎng)條件下無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體。 ? 5）蓋片分離法 ； 、大小形態(tài)適用的選出； ； ，挑出單細(xì)胞玻片； 。 胚胎成纖維細(xì)胞因在細(xì)胞培養(yǎng)條件下有分裂增殖的能力，故只適應(yīng)于軟瓊脂平板法培養(yǎng)中，該細(xì)胞鋪于平板的底層。 ? DNA合成途徑有兩種。我們首先分析用 PEG作融合劑時(shí)的條件選擇。 ? 體內(nèi)法：對細(xì)胞或微生物抗原可直接注射如小鼠體內(nèi)，可溶性蛋白抗原可與等量的福氏完全佐劑混合乳化后，注入到動物體內(nèi)。 ? 親本 A： HGPRT /TK+ ? 親本 B： HGPRT+ / TK ? 雜交細(xì)胞： HGPRT+ / TK+ ? 在 HAT培養(yǎng)基中雜交細(xì)胞存活， A、 B死亡 2） 營養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng)： 細(xì)胞在缺乏一 種或幾種營養(yǎng)成分時(shí)，不能生長繁殖 即營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。 ? 2）注意控制高頻交流電壓和直流脈沖電壓的強(qiáng)度和時(shí)間，以防止細(xì)胞連接成串或發(fā)生可逆性降解。 2化學(xué)法（聚乙二醇） ? PEG: 聚乙二醇（ polyethylene glycol, PEG） ? 分子式： HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH ? 性狀：白色蠟狀固體，具有強(qiáng)烈