【正文】 (三)中心粒(Centriole) 白血病細(xì)胞的中心粒電鏡照片：中心粒是相互垂直的兩個短筒狀小體，從橫切面看，每個短簡由9組三聯(lián)體微管組成。轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察，可見中心體的外圍還有星狀的放射細(xì)絲即星體。神經(jīng)細(xì)胞的胞體呈圓形或橢圓形。 2．觀察（陽光充足時效果較好）。在沒用藥的標(biāo)本上，成纖維細(xì)胞多數(shù)有突起，微絲沿突起規(guī)則排列；用細(xì)胞松馳素B處理的標(biāo)本，由于微絲被破壞突起縮回，多數(shù)細(xì)胞形狀變圓；用藥處理后又洗去藥的標(biāo)本，由于解除了藥的作用，肌動蛋白重新聚臺形成微絲，細(xì)胞形狀恢復(fù)正常。5．染色處理①將需染色的蓋片放入盛有PBS的平皿內(nèi)用吸管輕輕吹洗蓋片，換液三次，每次3分鐘，洗去培養(yǎng)液。三、試劑 PBS()、2％Triton X—100液、M—緩沖液、3％戊二醛固定液、％考馬斯亮蘭染液、100μg／ml的細(xì)胞松馳素B、DMEM培養(yǎng)液。 (二)方法 取一只蟾蜍，破壞腦和脊髓，剪開胸腔，取胸骨劍突軟骨最薄部分的一小片，放在載片上，滴兩滴1／3000中性紅染液，染色8～lO分鐘，用吸水紙吸去染液，加一滴Ringer氏液，蓋上蓋片，吸去多余Ringer氏液?！咀? 業(yè)】 繪制光鏡下肝細(xì)胞活體染色所見的線粒體及電鏡下腎小管上皮細(xì)胞中線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)。 線粒體脊的數(shù)目與分布方式是多種多樣的。當(dāng)組織塊邊緣染成籃色時即可，一般需要染30分鐘。 二、器材和儀器 顯微鏡、手術(shù)器材一套、解剖盤、小平皿、載片、蓋片、吸水紙、10ml注射器、吸管。因此，用前必須測定。圖1—1血涂片的制備 5．人血涂片的制備與觀察 取人血一滴，制片方法同上。染色用甲基蘭。在壓片上滴一滴甲苯胺蘭染液，染色10分鐘，蓋上蓋片，吸去多余染液。例如：具有收縮機能的肌細(xì)胞伸展為細(xì)長形；具有感受刺激和傳導(dǎo)沖動機能的神經(jīng)細(xì)胞有長短不一的樹枝狀突起；游離的血細(xì)胞為圓形、橢圓形或圓餅形。 三、各部結(jié)構(gòu)名稱要在一側(cè)引直線注明。 3．大剪刀：用于剪毛、皮膚、皮下組織和肌肉等。角刺穿腹部肌肉而進(jìn)入腹腔(刺穿腹肌時有一落空感)。用左手的拇指和食指抓住其頭頂部皮膚，然后用左手小指與手掌之間夾住其尾巴。 1．雌雄鑒別 通常雄性蟾蜍較雌性的為小，且在其前肢的l～3趾基部有被稱為婚墊的黑疣。 八、動物尸體、紙片及實驗廢物應(yīng)放到指定地點，不得隨意亂丟。 五、實驗室內(nèi)各組儀器及器材由各組自已使用，不得互相調(diào)換?，F(xiàn)在第四版在1993年第三版基礎(chǔ)上對部分實驗進(jìn)行了補充和修改，并增加了“酸性磷酸酶的顯示”實驗。 細(xì)胞生物學(xué)實驗課的教學(xué)目的，主要是通過基本技能訓(xùn)練以及觀察分析實驗結(jié)果，使學(xué)生了解并掌握有關(guān)的實驗技術(shù)原理和操作方法，進(jìn)而培養(yǎng)學(xué)生動手實踐、觀察分析和解決問題的能力。 本教材由王蕓慶主編、謝榮林副主編，參加編寫的有陳興、謝榮林、寧剛、劉冬杰、黃東陽、紀(jì)曉輝、時偉紅、朱亞勤、黃集前、王明武、畢衛(wèi)真、張婕、三維琴和王世藩。 三、保持實驗室安靜，不許在實驗室內(nèi)大聲喧嘩及隨意走動。 七、保持實驗室內(nèi)清潔整齊。 在我們細(xì)胞生物學(xué)實驗中，除應(yīng)用培養(yǎng)細(xì)胞外，最常用的動物是蟾蜍和小白鼠，下面對其特點及基本處置做一簡單的介紹。如此直至其四肢松軟，呼吸消失為止。 3．給藥方法： 小自鼠的給藥途徑有經(jīng)口給藥、腹腔內(nèi)注射、尾靜脈注射、皮下注射、皮內(nèi)注射和肌肉注射等。 2．解剖刀(即外科手術(shù)刀)：用于各種皮膚切口和組織切除等。 7．有鉤鑷子：用于提取皮膚切口等。 二、器材和儀器 配有目鏡測微尺的顯微鏡一臺、載片十張、蓋片三張、吸水紙、手術(shù)器材一套、解剖盤一個、鏡臺測微尺一個、小平皿一個、牙簽。 取蟾蜍一只，破壞腦和脊髓，在口裂處剪去頭部，除去延腦，剪開椎管，可見乳白色脊髓，取下脊髓放在平皿內(nèi)，用Ringer氏液洗去血液后放在載片上，剪碎。在顯微鏡下觀察，肌細(xì)胞為細(xì)長形，可見折光不同的橫紋，每個肌細(xì)胞有多個核，分布于細(xì)胞的周邊(參照照片)。晾干。 二、測微尺的使用 (一)原理 測微尺分目鏡測微尺和鏡臺測微尺，兩尺配合使用。 三、計算蟾蜍紅細(xì)胞的核質(zhì)比例。詹納斯綠 B是線垃體的專一性活體染色劑。 三．線粒體的電鏡照片觀察 不同細(xì)胞中線粒體的形態(tài)和數(shù)目不同。第二張是恒河猴脊髓突觸內(nèi)線粒體?！緦嶒瀮?nèi)容】 一、蟾蜍胸骨劍突軟骨細(xì)胞液泡系活體染色及觀察 (一)原理在動物細(xì)胞內(nèi)，凡是由膜所包圍的小泡和液泡除線粒體外都屬于液泡系，包括高爾基器、溶酶體、微體、消化泡、自噬小體、殘體、胞飲液泡和吞噬泡，都是由一層單位膜包圍而成。(時偉紅編)實驗四 細(xì)胞中的微絲染色及微絲與細(xì)胞形態(tài)的實驗觀察【實驗?zāi)康摹? 掌握微絲的染色方法，了解光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下微絲的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。3. 將用細(xì)胞松弛素B處理過的兩張蓋片取一張做染色處理，另一張用培養(yǎng)液洗五次（在平皿內(nèi)換五次培養(yǎng)液，每次都要搖動），繼續(xù)培養(yǎng)、觀察。 ⑤％考馬斯亮蘭染液中，染色15分鐘。成束的微絲出現(xiàn)在外質(zhì)與內(nèi)質(zhì)接口(溶膠和凝膠接口)并交織一起，與環(huán)流方向平行?！咀? 業(yè)】繪出三種不同情況下細(xì)胞中微絲的分布。轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察，可見脊髓前角神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中許多藍(lán)色顆粒或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)即為尼氏小體。在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜外表面附著許多小顆粒，即核糖體。內(nèi)外核膜相距一定的距離結(jié)合形成核孔。其中有許多膜性結(jié)構(gòu)形成扁平囊狀或管泡狀，密集成排的膜上附有顆粒，這就是粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)?！緦嶒瀮?nèi)容】一、細(xì)胞的吞噬活動 (一)原理 白細(xì)胞是機體防御系統(tǒng)中能游走的單位。 2．實驗時，每組取一只經(jīng)上述處理的小鼠，腹腔注射1％雞血懸液0．5～1ml，注射后輕揉小鼠腹部以使紅細(xì)胞懸液分散均勻。 步驟：1．將顯微鏡聚光器調(diào)到最高位，用低倍鏡調(diào)焦至清楚。 3．沿蟾蜍二側(cè)口角向后剪開約l厘米，將下頜翻轉(zhuǎn)固定在腹部。 3．移取洗凈的精巢于另一干凈的平皿上，用眼科剪將精巢充分剪碎后，加入數(shù)滴自來水混勻。纖毛有規(guī)律的擺動使食物在胞咽聚結(jié)形成食物泡(吞噬泡)，最后脫離胞咽入胞質(zhì)。 2)幾分鐘后可見草履蟲體內(nèi)出現(xiàn)許多紅色食物泡，隨著食物泡不停的在胞質(zhì)中環(huán)流，食物不斷消化，泡內(nèi)酸性減弱或近中性，顏色漸漸呈黃色，食物泡漸小，最后食物泡顏色呈藍(lán)色，不能被消化的殘渣，環(huán)流到身體后部的胞肛排出，不排出時不易見到胞肛。由此對細(xì)胞中的DNA和RNA進(jìn)行定位、定性、和定量分析。 7．放入純二甲苯中透明5分鐘。2. 將涂片作好標(biāo)記放在70％乙醇中固定5分鐘，室溫晾干。 三、細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶的顯示（一）原理過氧化物酶能把許多胺類氧化為有色化合物，用聯(lián)苯胺處理標(biāo)本，細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶能把聯(lián)苯胺氧化為藍(lán)色的聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變?yōu)樽厣a(chǎn)物，因而可以根據(jù)顏色反應(yīng)來判定過氧化物酶的有無或多少。（三）結(jié)果涂片中可見一些細(xì)胞中存在著藍(lán)色或棕色顆粒，為過氧化物酶所在位置。6．浸入Schiff氏酒精液反應(yīng)15分鐘。 五、蘇丹Ⅲ染色——顯示細(xì)胞內(nèi)脂肪(示教片)【作 業(yè)】1． 用彩色筆繪出Brachet反應(yīng)及PAS反應(yīng)的鏡下所見。 分級分離(Fractionation)由低速到高速離心逐漸沉降。 5．／L氯化鈣溶液懸浮沉淀物，以2500rpm離心15分鐘棄上清，將殘留液體用吸管吹打成懸液，滴一滴于干凈的載玻片上，涂片③，自然干燥。 2．比較一下分離細(xì)胞核時涂片①、②、③有什么不同?涂片③在你的實驗結(jié)果中純度如何？2． 描述一下涂片⑤所見結(jié)果。 蛙紅細(xì)胞體積較大、數(shù)多，而且有核，是觀察無絲分裂的較好材料。尋找和觀察處于分裂間期和有絲分裂不同時期的細(xì)胞形態(tài)變化，并轉(zhuǎn)換高倍鏡仔細(xì)觀察。換高倍鏡仔細(xì)觀察不同分裂時期的細(xì)胞形態(tài)特征．與動物細(xì)胞有絲分裂特征比較，找出植物細(xì)胞有絲分裂的特點和兩者的區(qū)別。固定后移入70％乙醇中存放于4℃冰箱備用。偶線期（zygotene stage）同源染色體開始配對，同時出現(xiàn)極化現(xiàn)象，各以一端聚集于細(xì)胞核的一側(cè)，另一端則散開，形成花束狀。(4)末期I(Telophase I移動到兩極的染色體，呈聚合狀態(tài)，并解旋，同時核膜形成，胞質(zhì)也均分為二，即形成兩個次級精母細(xì)胞，這時每個新核所含染色體的數(shù)目只是原來的一半。鏡下精子頭部呈梭形，由細(xì)胞核及頂體共同組成，尾部細(xì)長呈線狀。 三、試劑 1640培養(yǎng)液、500單位／ml的肝素溶液、10μg／ml的秋水仙素溶液、％％EDTA混合消化液,O．5mg／ml的PHA溶液、／L的KCl溶液，甲醇、冰醋酸、Giemsa原液、磷酸緩沖液()、生理鹽水等。 (二)操作 1．打開超凈臺紫外燈20～30分鐘。每天輕輕震蕩培養(yǎng)瓶二、三次，防止血球沉積并保證血細(xì)胞與培養(yǎng)液充分接觸，促進(jìn)細(xì)胞生長繁殖。再吹打成細(xì)胞懸液，加入預(yù)熱37℃的 ／L的KCL溶液9ml，置37℃水浴中低滲處理30分鐘(這期間配制3:1甲醇一冰醋酸固定液)。 6．將標(biāo)本面朝下放在染色槽中，加入染液染10分鐘，自來水沖洗，晾干后觀察。 (二)操作 l． 105個／ml細(xì)胞濃度將FL—60細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，／，移入10ml離心管。在標(biāo)本中選擇一個染色體之間分散較好，互不重疊的中期分裂相，置于視野中央，然后換油鏡仔細(xì)觀察。 接著確定B組：B組二對即第4～5號4條染色體，較大，均為亞中著絲點，兩者不易區(qū)分開。圖15—1 各組染色體基本形態(tài)特征的模式圖【作 業(yè)】 一、計數(shù)HeLa和HL一60細(xì)胞的染色體數(shù)，它們各屬哪種數(shù)目異常? 二、分析制備好的正常人外周血淋巴細(xì)胞染色體，判斷其性別。PEG的促融機制尚不完全清楚，它可能引起細(xì)胞膜中磷脂的酰鍵及極性基團發(fā)生結(jié)構(gòu)重排。 (5)緩慢滴加9ml Hanks液以終止PEG的作用，在37℃水浴內(nèi)靜置5分鐘。 三、試劑 50％PEG、Hanks液()、RPMI一1640培養(yǎng)基(含10％滅活小牛血清，)10μg／ml秋水仙素，／L KCl低滲液、2％檸檬酸鈉溶液、％次甲基蘭染液、1／15mol／L PBS、Carnoy固定液、Giemsa染液。將含有M期細(xì)胞的培養(yǎng)基移入離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清加人5ml Hanks液，用吸管吹打成細(xì)胞懸液。 (2)用指彈法彈散細(xì)胞，在37℃ 50％PEG，逐滴加入離心管內(nèi)，并不斷地輕輕搖動，整個過程約90秒鐘。其形態(tài)特點。在37℃水浴甲靜置5分鐘。％的胰蛋白酶消化2～3分鐘，棄去胰酶消化液。 七十年代初，由于發(fā)現(xiàn)M期細(xì)胞內(nèi)有某種促進(jìn)染色體凝集因子，它無種屬特異性，所以在細(xì)胞融合和染色體技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立了制備染色體提前凝集標(biāo)本的方法。 三、結(jié)果觀察 在高倍鏡下可以看到有兩個或兩個以上的雞紅細(xì)胞膜融合在一起，形成一個異核體細(xì)胞。 (2)(MW=4,000)放入試管內(nèi)，在酒精燈上融化之，％的PEG溶液。(王明武編)實驗十一 細(xì) 胞 融 合【實驗?zāi)康摹空莆占?xì)胞融合原理、應(yīng)用PEG融合細(xì)胞的方法以及細(xì)胞融合率的計算。G組二對即第21～22號4條染色體，是最小的一組，均為近端著絲點，短臂末端有隨體，長臂常呈分叉狀，21號稍小于22號。計數(shù)時要把分散的染色體劃分為幾個區(qū)域以免計數(shù)重復(fù)或遺漏，然后計數(shù)并判定性別。 :2傳代進(jìn)行培養(yǎng)，／ml的秋水仙素處理3小時。 油鏡下觀察可見每一條染色體都含有兩條染色單體，兩條單體由著絲粒相結(jié)。平衡后以1000rpm離心8分鐘，同樣剩 。然后收集細(xì)胞，低滲處理，使細(xì)胞脹大，染色體伸展。啟動超凈臺，點燃煤氣燈。期不再增殖。 二、繪制馬蛔蟲受精卵有絲分裂的各期細(xì)胞圖像，并注明結(jié)構(gòu)名稱? 三、小結(jié)有絲分裂與減數(shù)分裂過程的異同點。 3．減數(shù)分裂Ⅱ(Meiotic divisison Ⅱ)減數(shù)分裂Ⅱ類似一般的有絲分裂，但從細(xì)胞形態(tài)上看，可見胞體明顯變小，染色體數(shù)目少。雙線期(Diplotene stage)染色體縮的更短些，同源染色體開始有彼此分開的趨勢，但因兩者相互絞纏，有多點交叉，所以這時的染色體呈現(xiàn)麻花狀。 5．壓片 在染色材料上蓋上蓋玻片，再在蓋玻片上放一塊吸水紙，用大拇指垂直在蓋玻片上適力下壓(壓片時不要滑動蓋片)使精細(xì)管破裂細(xì)胞平展開，吸去溢出的染液，即可觀察。減數(shù)分裂過程中體現(xiàn)了遺傳三定律，所以說減數(shù)分裂在穩(wěn)定種的遺傳性狀和繁殖中均起著重要作用。兩個原核形態(tài)相似不易分辨，核內(nèi)染色質(zhì)分布比較均勻，核膜、核仁清楚，細(xì)胞核附近可見中心粒存在。 二、細(xì)胞有絲分裂的觀察一馬蛔蟲子宮切片、洋蔥根尖切片 (一)原理 細(xì)胞有絲分裂(Mitosis)的現(xiàn)象是分別由弗勒明(Flemming，1882)在動物細(xì)胞和施特拉斯布格(Strasburger，1880)在植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)?！緦嶒炗闷贰? 一、材料和標(biāo)本 蛙血涂片、馬蛔蟲子宮切片和洋蔥根尖切片、固定的蝗蟲精巢。 (二)結(jié)果 分別于高倍鏡下觀察三張涂片，描述鏡下所見。由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心開始時均勻分布在整個離心管中，所以每級離心得到的第一次沈淀必然不是純的最重的顆粒，須經(jīng)反復(fù)懸浮和離心加以純化?！緦嶒炗闷贰? 一、材料和標(biāo)本 小白鼠、冰塊。 8．流水沖洗3～5分鐘。 (二)方法 l．取l~2mm厚的肝組織塊，用Carnoy氏液4℃固定4～6小時。2．推片，室溫晾干。4．清水沖洗多次（3分鐘以上），以沖去痕跡的三氯醋酸。9．鏡下觀察（三）結(jié)果細(xì)胞質(zhì)被染成淺紅色，細(xì)胞核被染成藍(lán)綠色，而其中核仁被染成紫紅色（參照照片）。