【正文】 15。這使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。9．與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞的特點(diǎn)及這一特點(diǎn)對(duì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離的意義哺乳動(dòng)物及人的成熟的紅細(xì)胞是雙面凹圓餅狀，沒(méi)有細(xì)胞核和細(xì)胞器。6．G75“G”代表凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值。4．為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無(wú)效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過(guò)，攪亂洗脫液的流動(dòng)次序，影響分離的效果。如果色帶均勻、狹窄、平整，說(shuō)明凝膠色譜柱的性能良好。3．如何檢測(cè)凝膠色譜柱的裝填是否成功由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。2. 紅細(xì)胞的洗滌如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因?！占盅b蛋白質(zhì)：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集。加樣后，∣ 打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全滲入凝膠層后，↓ 關(guān)閉出口。3．純化調(diào)節(jié)緩沖液面：打開(kāi)色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝↓ 膠面平齊，關(guān)閉出口。②透析 取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中，透析12h。第一層為無(wú)色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。②血紅蛋白的釋放 在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。（3）分離過(guò)程：在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。3．凝膠電泳法：（1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。2．緩沖溶液（1）原理：由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成（如H2CO3－NaHCO3， NaH2PO4/Na2HPO4等），調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。（3）分離過(guò)程： 混合物上柱→洗脫→大分子流動(dòng)快、小分子流動(dòng)慢→收集大分子→收集小分子＊ 洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。1．凝膠色譜法（分配色譜法）：（1）原理：分子量大的分子通過(guò)多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；分子量小的分子穿過(guò)多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。5．凝膠珠的顏色和形狀如果制作的凝膠珠顏色過(guò)淺、呈白色，說(shuō)明海藻酸鈉的濃度偏低，固定的酵母細(xì)胞數(shù)目較少；如果形成的凝膠珠不是圓形或橢圓形，則說(shuō)明海藻酸鈉的濃度偏高，制作失敗，需要再作嘗試。：冷卻后再混合，注意混合均勻，不要進(jìn)入氣泡：高度適宜，并勻速滴入4．剛形成的凝膠珠應(yīng)在CaCL2溶液中浸泡一段時(shí)間，以便Ca2+與Na+充分交換，形成的凝膠珠穩(wěn)定。 b) 將150mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的葡萄糖溶液轉(zhuǎn)移到200mL的錐形瓶中，再加入固定好的酵母細(xì)胞，置于25℃下發(fā)酵24h。將這些凝膠珠在CaCl2溶液中浸泡30 min左右。 【注】冷卻至室溫的目的：防止殺死酵母菌5。 4。加人10mL水，用酒精燈加熱，邊加熱邊攪拌，將海藻酸鈉調(diào)成糊狀，直至完全溶化，用蒸餾水定容至10 mL。 3。 稱取無(wú)水CaCl2 。細(xì)胞的活化稱取lg干酵母，放入50 mL的小燒杯中，加人蒸餾水10 mL，用玻璃棒攪拌，使酵母細(xì)胞混合均勻，成糊狀，放置1h左右，使其活化。固定化細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：成本更低，操作更容易，可以催化一系列的化學(xué)反應(yīng)。這是因?yàn)榧?xì)胞個(gè)大，而酶分子很??；個(gè)大的難以被吸附或結(jié)合，而個(gè)小的酶容易從包埋材料中漏出。2．固定化酶和固定化細(xì)胞是利用物理或化學(xué)方法將酶或細(xì)胞固定在一定空間內(nèi)的技術(shù)，包括包埋法、化學(xué)結(jié)合法和物理吸附法。生產(chǎn)過(guò)程中，將葡萄糖溶液從反應(yīng)柱的上端注入，使葡萄糖溶液流過(guò)反應(yīng)柱，與固定化葡萄糖異構(gòu)酶接觸，轉(zhuǎn)化成果糖，從反應(yīng)柱的下端流出。 課題二 酵母細(xì)胞的固定化一、實(shí)驗(yàn)原理1．使用固定化酶技術(shù)，將這種酶固定在一種顆粒狀的載體上，再將這些酶顆粒裝到一個(gè)反應(yīng)柱內(nèi)，柱子底端裝上分布著許多小孔的篩板。DNA初步純化………… 與等體積95％冷卻酒精混合，析出白色絲狀物↓→除去核蛋白、RNA、多糖等。試管2支，編號(hào)甲乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放入少量白色絲狀物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均勻→沸水浴5min→觀察顏色變化實(shí)驗(yàn)操作制備雞血細(xì)胞液…………加檸檬酸鈉，靜置或離心↓破碎細(xì)胞，釋放DNA… 加蒸餾水，同一方向快速通方向攪拌↓→過(guò)濾，除去細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等。在濾液中仍然含有一些雜質(zhì)，怎樣除去這些雜質(zhì)呢？得到的DNA呈何顏色？濾液與等體積的冷卻酒精混合均勻，靜置2～3分鐘，析出的白色絲狀物就是DNA。方案二與方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi)；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。最初獲得的DNA濾液含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)，需要進(jìn)一步提純DNA。10mL雞血＋20mL蒸餾水→同方向攪拌→3層尼龍布過(guò)濾→濾液去除濾液中的雜質(zhì)為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。在以上實(shí)驗(yàn)中，加入蒸餾水、洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？過(guò)濾時(shí)應(yīng)當(dāng)選用（濾紙、尼龍布）。為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？答：蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。若選用雞血和洋蔥作實(shí)驗(yàn)材料，則怎樣獲取含DNA的濾液？在雞血細(xì)胞液中加入一定量蒸餾水并用玻棒攪拌，過(guò)濾后收集濾液；切碎洋蔥，加入一定量洗滌劑和食鹽，攪拌研磨，過(guò)濾后收集濾液。雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取過(guò)程中為了減少DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細(xì)胞液。本實(shí)驗(yàn)用雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料有兩個(gè)原因。實(shí)驗(yàn)材料的選取不同生物的組織中DNA含量不同。當(dāng)鑒定提取出的物質(zhì)是否是DNA時(shí)，需要使用什么指示劑進(jìn)行鑒定？在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺呈現(xiàn)藍(lán)色。洗滌劑在提取DNA中有何作用？洗滌劑將細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，從而瓦解細(xì)胞膜。補(bǔ)充：DNA的變性是指DNA分子在高溫下解螺旋，其溫度在80℃以上，如在PCR技術(shù)中DNA變性溫度在95℃。利用該原理時(shí)，應(yīng)選用怎樣的酶和怎樣的溫度值？蛋白酶，因?yàn)槊妇哂袑Ｒ恍裕鞍酌钢凰獾鞍踪|(zhì)而不會(huì)對(duì)DNA產(chǎn)生影響。從理論上分析，預(yù)冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點(diǎn)。在溶解細(xì)胞中的DNA時(shí)，人們通常選用2mol/LNaCl溶液；將DNA分子析出的方法是向溶有DNA的Na