【正文】 微生物實(shí)驗(yàn)室建設(shè)與生物安全防護(hù)1微生物的生理生化及血清學(xué)實(shí)驗(yàn)衛(wèi)生微生物學(xué)的檢測方法、標(biāo)準(zhǔn)微生物的接種與培養(yǎng)技術(shù)微生物的滅菌與除菌 　　染色的結(jié)果，革蘭氏正反應(yīng)菌體都呈紫色，負(fù)反應(yīng)菌體都呈紅色?！　。罚┺t梁色液（?。┤?0秒鐘后，自來水沖洗?！　。担┧?，用吸水紙吸去水分?！　。常┳詠硭疀_洗。　　革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟，具體操作方法是：　?。保┩科潭ā４送?，兩類菌的細(xì)胞壁等對結(jié)晶紫—碘復(fù)合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以染色時(shí)的條件要嚴(yán)格控制。現(xiàn)在一般認(rèn)為革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色，陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度底，吸附染料差，易脫色，這是染色反應(yīng)的主要依據(jù)。有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)和球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進(jìn)行復(fù)染。２、革蘭氏染色法　　革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立?！　　　∶捞m染色液：著色慢，時(shí)間長，效果清晰，菌體呈蘭色。　　單染色一般要經(jīng)過涂片、固定、染色、水洗和干燥五個(gè)步驟。若使用酸性染料，多用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅等。在一般情況下，細(xì)菌菌體多帶負(fù)電荷，易于和帶正電荷的堿性染料結(jié)合而被染色。食品微生物檢驗(yàn)中常用的是單染色法和革蘭氏染色法。故亦稱鑒別染色法。前者用一種染料使微生物染色，但不能鑒別微生物?！　【C上所述，染色的基本程序如下：　　制片→固定→媒染→染色→脫色→復(fù)染→水洗→干燥→鏡檢。８、干燥　　著色標(biāo)本洗凈后，將標(biāo)本晾干，或用吸水紙把多余的水吸去，然后晾干或微熱烘干，用吸水紙時(shí)，切勿使載玻片翻轉(zhuǎn)，以免將菌體擦掉。革氏染色在酒精脫色后用番紅，石碳酸復(fù)紅最后進(jìn)行染色，就是復(fù)染。常用的脫色劑是95%酒精和3%鹽酸溶液。５、脫色　　用醇類或酸類處理染色的細(xì)胞，使之脫色?！　∪糇鲝?fù)合染色，在媒染處理時(shí)，媒染劑與染料形成不溶性化合物，可增加染料和細(xì)菌的親和力。染色的時(shí)間各不相同，視標(biāo)本與染料的性質(zhì)而定，有時(shí)染色時(shí)還要加熱。應(yīng)用餓酸固定細(xì)胞的技術(shù)如下：在培養(yǎng)皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛細(xì)管，在毛細(xì)管中注入少量的1—2%餓酸溶液，同時(shí)在玻璃上再放置濕標(biāo)本涂片的載玻片，然后把培養(yǎng)皿蓋上，經(jīng)過1—2分鐘后把標(biāo)本從培養(yǎng)皿中取出，并使之干燥?；瘜W(xué)固定法最常用的固定劑有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，1—2%的餓酸等?！　」潭ǔ３＠酶邷?，手執(zhí)載玻片的一端（涂有標(biāo)本的遠(yuǎn)端），標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3—4次，共約2—3秒鐘，并不時(shí)以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷后，進(jìn)行染色。　?。玻┍ＷC菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標(biāo)本被水沖洗掉。自然干燥　　涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時(shí)為了使之干得更快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。制片和染色的基本程序　　微生物的染色方法很多，各種方法應(yīng)用的染料也不盡相同，但是一般染色都要通過制片及一套染色操作程序。中性（復(fù)合）染料　　酸性染料與堿性染料的結(jié)合物叫做中性（復(fù)合）染料，如瑞脫氏（Wright）染料和基姆薩氏（Gimsa）染料等，后者常用于細(xì)胞核的染色。堿性染料　　這類染料電離后染料離子帶正電，可與酸性物質(zhì)結(jié)合成鹽。酸性染料　　這類染料電離后染料離子帶負(fù)電，如伊紅、剛果紅、藻紅、苯胺黑、苦味酸和酸性復(fù)紅等，可與堿性物質(zhì)結(jié)合成鹽。為使它們易溶于水，通常制成鹽類。目前主要采用人工染料，也稱煤焦油染料，多從煤焦油中提取獲得，是苯的衍生物。 二、染料的種類和選擇　　染料分為天然染料和人工染料兩種?！　∮绊懭旧钠渌蛩?，還有菌體細(xì)胞的構(gòu)造和其外膜的通透性，如細(xì)胞膜的通透性、膜孔的大小和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整與否，在染色上都起一定作用。因此，帶陰電的細(xì)菌常和帶陽電的堿性染料進(jìn)行結(jié)合。相反，堿性物質(zhì)（如細(xì)胞質(zhì)）通常僅能染上酸性染料，若把它們變?yōu)檫m宜的物理形式，也同樣能與堿性染料發(fā)生吸附作用。如酸性物質(zhì)細(xì)胞核對于堿性染料就有化學(xué)親和力，易于吸附?；瘜W(xué)因素則是根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生地各種化學(xué)反應(yīng)?！　”竟?jié)包括四部分：　　一、染色的基本原理　　二、染料的種類和選擇　　三、制片和染色的基本程序 　　四、染色方法 一、染色的基本原理　　微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。但是，任何一項(xiàng)技術(shù)都不是完美無缺的。染色技術(shù) 　　由于微生物細(xì)胞含有大量水分（一般在8090%以上），對光線的吸收和反射與水溶液的差別不大，與周圍背景沒有明顯的明暗差。 6．顯微鏡用完后，取下標(biāo)本片，經(jīng)聚光器降下，再將物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器使鏡筒下降，以免接物鏡與聚光器相碰。 5．接目鏡和接物鏡不要隨便抽出和卸下必須抽取接目鏡時(shí)，須將鏡筒上口凈用布遮蓋，避免灰塵落入鏡筒內(nèi)。如透鏡部分不潔時(shí)，用擦鏡紙輕擦，如有油污，先將擦鏡紙蘸少許二甲苯拭去。 2．顯微鏡放到實(shí)習(xí)臺上時(shí)，先放鏡座的一端，再將鏡座全部放穩(wěn)，切不可使鏡座全面同時(shí)與臺面接觸，這樣震動過大，透鏡和微調(diào)節(jié)器的裝置易損壞。 虎克時(shí)代的顯微鏡三、顯微鏡的保養(yǎng) 1．顯微鏡在從木箱中取出或裝箱時(shí)，右手緊握鏡臂，左手穩(wěn)托鏡座，輕輕取出。(注：反光鏡通常應(yīng)垂直放，但有時(shí)因集光器沒提至應(yīng)有高度，鏡臺下降時(shí)會碰壞光圈，所以這里改為平放) 　　■使用完畢后，必須復(fù)原才能放回鏡箱內(nèi)，其步驟是：取下標(biāo)本片，轉(zhuǎn)動旋轉(zhuǎn)器使鏡頭離開通光孔，下降鏡臺，平放反光鏡，下降集光器(但不要接觸反光鏡)、關(guān)閉光圈，推片器回位，蓋上綢布和外罩，放回實(shí)驗(yàn)臺柜內(nèi)。 　　■要養(yǎng)成兩眼同時(shí)睜開觀察的習(xí)慣，以左眼觀察視野，右眼用以繪圖。 　　■水滴、酒精或其它藥品切勿接觸鏡頭和鏡臺，如果沾污應(yīng)立即用擦鏡紙擦凈。 　　■輕拿輕放，不可把顯微鏡放置在實(shí)驗(yàn)臺的邊緣，應(yīng)放在距邊緣10cm處，以免碰翻落地。對光時(shí)，如果視野光線太強(qiáng)，則使用反光鏡的平面，如果光線仍舊太強(qiáng)，則同時(shí)使用較小的光圈；反之，如果視野內(nèi)光線較弱，則使用較大的光圈或使用反光鏡的凹面。：反光鏡通常與遮光器（或光圈）配合使用，以調(diào)節(jié)視野內(nèi)的亮度。 h．標(biāo)本觀察完畢后，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器將鏡筒升起，取下標(biāo)本玻片。 f．轉(zhuǎn)動微調(diào)節(jié)器，使視野物象達(dá)到最清晰的程度。 d．俯身鏡旁側(cè)面在肉眼的觀察下，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器使油鏡頭徐徐下降浸入香柏油內(nèi)，輕輕接觸玻片為止。 b．轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器使鏡筒上升，滴香柏油1小滴（不要過多，不要涂開）于接物鏡正下方標(biāo)本上。于是采用一種和玻片折光率相接近的介質(zhì)如香柏油，加于標(biāo)本與玻片之間，使光線不通過空氣，這樣射入鏡頭的光線就較多，物象就看得清楚（圖2）。 ： （1）原理：使用油鏡觀察時(shí)，需加香柏油，因?yàn)橛顽R需要進(jìn)入鏡頭的光線多，但油鏡的透氣孔最小，這樣進(jìn)入的光線就少，物體不易看清楚。換用高倍鏡后，視野內(nèi)亮度變暗，因此一般選用較大的光圈并使用反光鏡的凹面，然后調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋。如果不清楚，可調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，至清楚為止。 ：①用手轉(zhuǎn)動粗準(zhǔn)焦螺旋，使鏡筒徐徐下降，同時(shí)兩眼從側(cè)面注視物鏡鏡頭，當(dāng)物鏡鏡頭與載物臺的玻片相距2～3mm時(shí)停止。 ：①鏡筒朝前，鏡臂朝后；②置于觀察者座位前的桌子上，偏向身體左側(cè)，便于左眼向目鏡內(nèi)觀察；③置于桌子內(nèi)側(cè)，距桌沿5cm左右。即目鏡長度越長，放大倍數(shù)越低；物鏡長度越長，放大倍數(shù)越高。 顯微鏡的放大倍數(shù)是物鏡的放大倍數(shù)與目鏡的放大倍數(shù)的乘積，如物鏡為10，目鏡為