基于分子生物學(xué)的長(zhǎng)江口外海域中微生物鑒定(參考版)
2025-04-07 23:18本頁(yè)面
【正文】 現(xiàn)在16SrRNA基因PCR擴(kuò)增與計(jì)算機(jī)分析相結(jié)合已被證明是鑒定病原菌快速、有效、準(zhǔn)確的方法,再加上生物芯片的不斷開發(fā)，相信在未來實(shí)踐的發(fā)展中，以16SrRNA為基礎(chǔ)的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)能更快、更準(zhǔn)確的對(duì)微生物進(jìn)行分類鑒定，微生物檢測(cè)將邁上更高的臺(tái)階，這樣對(duì)我們進(jìn)一步研究長(zhǎng)江口的微生物,加強(qiáng)微生物多樣性的研究,豐富我們對(duì)海洋微生物多樣性的認(rèn)識(shí),利用這些特殊的微生物資源奠定基礎(chǔ)。隨著分子分類的理論和方法的日趨成熟,其已逐步成為微生物資源調(diào)查和環(huán)境生態(tài)研究的一種強(qiáng)有力的工具。由于16SrRNA序列的保守性和存在的普遍性,以及核酸序列本身的穩(wěn)定性,序列分析的重現(xiàn)性極高,基于當(dāng)今分析技術(shù)的改進(jìn),應(yīng)用16SrRNA作為分子指標(biāo),可以實(shí)現(xiàn)快速、微量、準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的對(duì)微生物進(jìn)行分類鑒定。一些可能含有相同或相似序列的菌種或亞種,往往需測(cè)序才能鑒定,這就限制了其應(yīng)用于快速鑒定微生物的廣泛性。核糖體rRNA對(duì)所有生物的生存都是必不可少的。還有就是引物的設(shè)計(jì)，兩個(gè)引物中G+C堿基對(duì)的百分比(G+C%)應(yīng)盡量相似,避免引物自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)等二級(jí)結(jié)構(gòu),以減少“引物二聚體”的形成，所以在對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行解釋和推論時(shí)需要充分考慮這些因素。下面以PCR中出現(xiàn)的問題來說明。通過各個(gè)環(huán)節(jié)的嚴(yán)格無菌操作,選擇恰當(dāng)?shù)臄U(kuò)增循環(huán)次數(shù),DNA提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析的隔離措施,以及使用一次性吸頭等,可提高鑒定的正確性和可靠性。失敗的原因有很多，比如我們采集到的物品沒有及時(shí)操作，而且我們生活的環(huán)境和海洋微生物生活的環(huán)境不相同，可能導(dǎo)致海洋微生物不適合環(huán)境而死亡，因?yàn)樗劳龅奈⑸镏械腞NA很容易降解，這就使得微生物在采集到實(shí)驗(yàn)這一段很長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)我們很少采集到總的DNA；還有就是沒有很好的控制細(xì)菌污染問題。隨著基因組學(xué)的迅猛發(fā)展, 細(xì)菌16SrRNA間隔區(qū)序列數(shù)據(jù)庫(kù)不斷擴(kuò)大,運(yùn)用16SrRNA序列分析技術(shù)對(duì)微生物進(jìn)行分類鑒定,確定微生物在進(jìn)化中的位置,已成為微生物分類學(xué)中最重要的方法。通過從基因水平探索微生物群落的豐度、均勻度、分析菌種的變異情況等,可將微生物多樣性的研究提高到遺傳多樣性水平上,為全面認(rèn)識(shí)微生物多樣性在生態(tài)系統(tǒng)中的原始構(gòu)成、篩選出未知菌種提供了行之有效的技術(shù)手段。隨著科學(xué)的發(fā)展，以16SrDNA為基礎(chǔ)的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)體高了解析的靈敏度，在基因水平上擴(kuò)大了物種多樣性的視野，可以實(shí)現(xiàn)快速，微量，準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的對(duì)微生物進(jìn)行分類鑒定。（3）根據(jù)形態(tài)特征、理化特征、菌體某些化學(xué)成分對(duì)菌株進(jìn)行分類鑒定菌株的確很有用，至今這些特性的應(yīng)用十分有限。（1）在自然環(huán)境中有許多的菌種用傳統(tǒng)的方法無法培養(yǎng)出來，同時(shí)純培養(yǎng)分離忽略了氣候變化和生物相互作用的影響，丟失了大量的微生物資源。．用16SrDNA微生物鑒定的方法的優(yōu)點(diǎn)傳統(tǒng)的微生物分類是依賴純培養(yǎng)分離方法，通過表型特征和細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察，對(duì)其生理生化反應(yīng)和細(xì)胞組成成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析來實(shí)現(xiàn)分類鑒定的。嗜鹽性，嗜低溫性都是由于海洋獨(dú)特的環(huán)境所決定的。對(duì)寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌生態(tài)學(xué)的研究，能為有效控制海洋生物圈的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)提供可靠依據(jù)。由于海水中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比較稀薄，大多數(shù)細(xì)菌都是寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌。絕大多數(shù)海洋細(xì)菌都具有運(yùn)動(dòng)能力，這和微生物所生成的環(huán)境有關(guān)系，只有運(yùn)動(dòng)才能獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)。(2)從鑒定出的微生物的生理生化分析的結(jié)果來看，這些細(xì)菌大致有以下特性：運(yùn)動(dòng)性、異養(yǎng)或化能異養(yǎng)、寡營(yíng)養(yǎng)性、嗜鹽性，嗜低溫性，抵抗力強(qiáng)。采集地點(diǎn)位于潮間帶以外。10′124176。00′31176。(Pseudomonas 16S ribosomal RNA gene Pseudomonas 16S ribosomal RNA gene,)根據(jù)上面的步驟我們把剩下的微生物鑒定出來的結(jié)果列成表格的形式如表3.英文名稱屬別query coveragemax identCellvibrio sp.纖維弧菌屬60%96%Pseudomonas sp.假單胞菌屬92%91%Pseudomonas sp.假單胞菌屬92%95%Rheinheimera sp.棍著色菌屬61%92%Tepidiphilus sp.硫桿狀菌屬24%77%Pseudomonas sp.假單胞菌屬91%98%Bacillus pumilus短小芽孢桿菌43%99%Pseudomonas sp.假單胞菌屬45%85%Pseudomonas sp.假單胞菌屬98%99%Pseudomonas sp.假單胞菌屬98%94%Pseudomonas sp.假單胞菌屬97%97%Pseudomonas sp.假單胞菌屬98%96%Shewanella baltica波羅的海希瓦氏菌98%96%Shewanella sp.希瓦氏菌92%93%Serratia marcescens 粘質(zhì)沙雷氏菌94%98%Shewanella sp.希瓦氏菌88%91%Pectobacterium果膠桿菌屬98%93%Shewanella baltica 波羅的海希瓦氏菌98%98%Aeromonas sp.氣單胞菌81%90%Serratia proteamaculans變形斑沙雷氏菌99%96%Serratia marcescens粘質(zhì)沙雷氏菌菌株56%96%Shewanella sp.希瓦氏菌97%90%Aeromonas sp.氣單胞菌75%87%Shewanella baltica波羅的海希瓦氏菌99%99%Aeromonas sp.氣單胞菌97%89%Shewanella sp.希瓦氏菌99%99%Shewanella sp.希瓦氏菌86%94%Pseudomonas假單胞菌91%98%Shewanella sp.希瓦氏菌94%98%Aeromona daceae 氣單胞菌科細(xì)菌96%98%Aeromonas sp. 氣單胞菌98%98%Pseudomonas sp.假單胞菌82%96%Pseudomonas sp.假單胞菌93%99%Aeromonas salmonicida 殺鮭氣單胞菌91%98%Aeromonadaceae bacterium氣單胞菌科細(xì)菌22%90%Shewanella sp.希瓦氏菌98%98%Shewanella sp.希瓦氏菌86%81%Pseudomonas fluorescens熒光假單胞菌株91%95%Pseudomonas sp.假單胞菌96%96%Pseudomonas sp.假單胞菌屬83%90%Pseudomonas fluorescens 熒光假單胞菌98%97%Rahnella aquatilis 水生拉恩氏菌95%99%Rahnella aquatilis水生拉恩氏菌97%97%屬別的形態(tài)及生理生化特征的分析：從列表中測(cè)算出微生物的平均覆蓋度是85%，平均最大相似度是94%，這些數(shù)據(jù)表明鑒定微生物結(jié)果是比較可靠的。 A B圖2(A和B).細(xì)菌基因組DNA和16SrDNA的PCR產(chǎn)物 16SrDNA序列測(cè)定與種類鑒定對(duì)純化后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，我們獲得如下序列結(jié)果。提取出的基因組DNA經(jīng)過用16sRNA引物PCR后,均獲得了特異擴(kuò)增片段,擴(kuò)增片斷約1,400bp左右,此片斷為16SrDNA基因的全序列擴(kuò)增(如圖2B)。然后把獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已存在的細(xì)菌16SrDNA序列進(jìn)行相似性比較。I．待溴酚藍(lán)和二甲苯青在凝膠中遷移出適當(dāng)?shù)木嚯x,切斷電源,小心取出凝膠在紫外燈或紫外透射儀下檢查凝膠并攝影。DNA Loading buffer
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