【正文】 ? 因此，要想搞清凋亡的復(fù)雜而精致的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)看來尚需時日。 133 134 ? 凋亡機制的研究進展非常迅速，但仍有很多問題需要更進一步的了解。在細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中，不可能是簡單的一連串事件的組合。 ? 促進細胞凋亡的 Bax、 Bik、 Bak、 Bad、 Bid、Hrk、 BclxS等。 131 凋亡機制 132 重要的凋亡調(diào)控基因 ? Bcl2基因家族：新發(fā)現(xiàn)的成員使 Bcl2基因家族越來越龐大。 ? 線粒體在細胞凋亡中的作用包括：釋放 Caspases激活因子如 Cytoc；喪失電子轉(zhuǎn)移功能并減少能量的產(chǎn)生；線粒體跨膜電位的消失以及與 BCL2蛋白家族促凋亡和抑制凋亡功能相關(guān)等方面。功能上，激活的 Caspases可以水解包括細胞調(diào)節(jié)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、 DNA修復(fù)、組織平衡、細胞存活等環(huán)節(jié)中重要的蛋白，從而使細胞表現(xiàn)為凋亡特有的形態(tài)學(xué)及生化特征 : ? 細胞皺縮、斷裂，染色質(zhì)聚集， DNA降解，以及隨后的凋亡細胞被吞噬細胞迅速地清除等。盡管這些信號以及隨后的反應(yīng)途徑多種多樣， 但現(xiàn)已公認(rèn)，細胞凋亡后期的共同途徑是 Caspases的激活。 128 細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 ? 細胞內(nèi)、外的許多信號刺激可以誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡，如相應(yīng)配體結(jié)合死亡受體。 ? 細胞凋亡信號會引起 CED9在上述復(fù)合體上解離下來，激活 CED3并最終發(fā)生凋亡。 ? 研究發(fā)現(xiàn)了三個重要的基因： 促進凋亡的 CED3和 CED4 抑制細胞凋亡的 CED9. 126 ? CED3是一個蛋白酶，激活的 CED3可以水解靶蛋白從而使細胞死亡 . ? CED4+CED3→ 促進 CED3激活， ? CED9+CED4→ 阻止激活 CED3。 125 細胞凋亡的基本機制 ? 多細胞生物在凋亡過程中擁有相似的酶反應(yīng)機制。 ? 近幾年來對細胞凋亡的最活躍領(lǐng)域包括： 細胞凋亡進程中重要的 執(zhí)行者 Caspases。然而，也發(fā)現(xiàn)這一過程遠非原來想象的那樣簡單，而是包含了復(fù)雜的調(diào)控機制。 ? 自 1972年 Kerr提出細胞凋亡這一概念后，目前在很多生物學(xué)領(lǐng)域進行廣泛的研究。167。 ? 另一方面， 可使 TSG 5′ 端啟動子調(diào)控區(qū) CpG島異常甲基化，而抑制 mRNA轉(zhuǎn)錄作用，導(dǎo)致TSG 失活。 ? 如：腫瘤組織中 DNA常有異常甲基化作用。至于 DNA甲基化，它只是表遺傳因素中較重要的一種。 ? 這種變化容易誘發(fā)癌癥等疾病。 ? 表觀遺傳修飾也可記憶、遺傳，向傳統(tǒng)的 遺傳規(guī)律 /中心法則 提出挑戰(zhàn)。 表觀基因組學(xué) /遺傳學(xué) ? 在不影響 DNA序列的情況下對其修飾 ,不僅影響個體的發(fā)育而且可遺傳 . ? 如 :一卵雙生在同一環(huán)境中生 ,成年后表現(xiàn)出性格、健康等方面的差異 表觀遺傳。 ? 正如 Phillip Zamore 所說： 如果 miRNAs在進化的進程中如此高度保守而沒有任何實際功能的話，那真是大自然拿科研人員開涮，而且是一個殘酷的玩笑。 116 ? 基于上述的諸多問題，尋找一種有效的方法來研究miRNA將是目前面臨的首要問題。 在異常組織或是不適當(dāng)?shù)陌l(fā)育階段這些miRNA 的表達增加， 可能導(dǎo)致其靶基因（抑癌基因）的表達下降，引起腫瘤形成。 最后的結(jié)果可能導(dǎo)致過度增殖、侵入、凋亡的減少、不能正常分化或者去分化，引起腫瘤的形成。 最終的結(jié)果是，細胞生長、增殖、分化和死亡保持在一個正常的水平。 111 miRNA與 siRNA的聯(lián)系： ? 長度均為 22nt左右 均為 Dicer的產(chǎn)物： 5＇端是磷酸基 3＇端是羥基 ? 均需 Argonaute家族蛋白的 ? 存在同為 RISC的組分 ? 二者進化關(guān)系上可能的兩種推論： siRNA是 miRNA的補充 . miRNA在進化過程中替代了 siRNA. 沉默機制有重疊 112 展望： 如果 miRNA基因 正如所發(fā)現(xiàn)的 miRNA一樣多，那么它很可能在生命活動中具有十分廣泛的調(diào)節(jié)功能，對基因表達、生長發(fā)育和行為等都具有十分深遠和復(fù)雜的效應(yīng)。 ? ， miRNA可抑制靶標(biāo)基因的翻譯，也可以導(dǎo)致靶標(biāo)基因降解， 即在轉(zhuǎn)錄水平后和翻譯水平起作用 ，而 siRNA只能導(dǎo)致靶標(biāo)基因的降解，即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控。 ， miRNA是不對稱加工， miRNA僅是剪切 premiRNA的一個側(cè)臂，其他部分降解；而 siRNA對稱地來源于雙鏈 RNA的前體的兩側(cè)臂。 109 miRNA與 siRNA的不同點： miRNA是內(nèi)源的 ，是生物體的固有因素；而siRNA是人工體外合成的，通過轉(zhuǎn)染進入人體內(nèi)，是RNA干涉的中間產(chǎn)物。 RISC組分，所以其功能界限變得不清晰，如二者在介導(dǎo)沉默機制上有重疊。 Dicer酶的加工，是 Dicer的產(chǎn)物，所以具有 Dicer產(chǎn)物的特點。如 let7 果蠅 /線蟲。如 miR39/miR171 ? 3） 上述兩種模式均具備 。 106 miRNA與靶 mRNA的作用模式： ? 1） 二者不完全互補 ，即二者不完全時配對結(jié)合時，主要影響翻譯過程而對 mRNA的穩(wěn)定性無任何影響。 stem與蛋白 Argonaute相互作用，Argonaute將雙鏈劈開，釋放其中的一條鏈，與剩下的一條鏈（ guide strand，引導(dǎo)鏈）形成miRISC復(fù)合體。 Drosha將 stemloop與轉(zhuǎn)錄本 (transcript)其它部份分開。 104 PremiRNA ? PremiRNA 是由內(nèi)源性基因或內(nèi)含子的DNA反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄而來 ,它是一種長約70nt的非編碼 RNA,具有莖 環(huán)結(jié)構(gòu)也即發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。 103 miRNA的成熟 ? 據(jù)體內(nèi)外實驗研究表明 miRNA的生成至少需要兩個步驟： 1）由長的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本（ primiRNA)生成 70nt左右的 miRNA前體（ premiRNA)，該過程發(fā)生在 細胞核 。使用這種機制的 miRNA結(jié)合位點通常在 mRNA的 3’ 端非翻譯區(qū)。 ? 與靶 mRNA不完全互補的 miRNA在蛋白質(zhì)翻譯水平上抑制其表達。 ? 這種雙鏈很快被引導(dǎo)進入 (miRISC)復(fù)合體中，其中含有 Argonaute蛋白，并且成熟的單鏈 miRNA保留在這一復(fù)合物中。 RAN– GTP和 exportin 5 將這種前體分子輸送到細胞質(zhì)中。 99 100 101 ? microRNA (miRNA)基因通常是由 RNA聚合酶 II(Pol II)轉(zhuǎn)錄的，一般最初產(chǎn)物為大的具有帽子結(jié)構(gòu)(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴 (AAAAA)的 primiRNA。 ? miRNA對生長發(fā)育進行更為重要的調(diào)控作用。 廣泛存在于真核生物中。端的臂加工而來 )； (5)將物種縮寫置于 miRNA 之前，如 hsamiR195 ； ( 6 ) 確定命名規(guī)則之前發(fā)現(xiàn)的 miRNA，如 let7，則保留原來名字。 93 RNA的分類 細胞核和胞液 線粒體 功能 核蛋白體 RNA rRNA mt rRNA 核蛋白體組成成分 信使 RNA mRNA mt mRNA 蛋白質(zhì)合成模板 轉(zhuǎn)運 RNA tRNA mt tRNA 轉(zhuǎn)運氨基酸 不均一核 RNA hnRNA 成熟 mRNA的前體 小核 RNA snRNA 參與 hnRNA的剪接、轉(zhuǎn)運 小胞漿 RNA scRNA/7SLRNA 蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的 信號識別體的組成成分 94 小 RNA分子本身又包含了若干類 RNA，根據(jù)小 RNA 的生成、結(jié)構(gòu)和功能大約可分為以下三類： ? a miRNA （ microRNA) ? b siRNA (short interfering RNA) ? c 其他小 RNA miRNA制定了如下的命名規(guī)則： ? (1) miRNA 簡寫成 miR，再根據(jù)其被克隆的 ? 先后順序加上阿拉伯?dāng)?shù)字，如 miR21； ? (2)高度同源的 miRNA 在數(shù)字后加上英文小寫字母(a、 b 、 c??)，如 miR199a 和 miR199b； ? (3)由不同染色體上的 DNA序列轉(zhuǎn)錄加工而成的具有相同成熟體序列的 miRNA，則在后面加上阿拉伯?dāng)?shù)字以區(qū)分 , 如 miR199a1 和 miR199a2； miRNA制定了如下的命名規(guī)則 (4)如果一個前體的 2 個臂分別加工產(chǎn)生 miRNA，則根據(jù)克隆實驗，在表達水平較低的 miRNA 后面加“ *” ，如 miR199a和 miR199a*，或進行如下命名， miR1425p(也可命名為 miR142s，表示從 5 180。 92 microRNA簡介 ? 近年來，人類發(fā)現(xiàn)了許多不同種類的microRNA分子，其中最為重要的是小RNA分子的發(fā)現(xiàn)。因此，可以利用 RNAi現(xiàn)象產(chǎn)生抗病毒的植物和動物，并可利用不同病毒轉(zhuǎn)錄序列中高度同源區(qū)段相應(yīng)的 dsRNA抵抗多種病毒。 因此，認(rèn)為 RNAi技術(shù)將可能成為研究細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的新途徑。 RNAi的應(yīng)用前景 90 2. 研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的新途徑 ? 聯(lián)合利用傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)和 RNAi技術(shù) ,可以很容易地 確定復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中不同基因的上下游