【正文】 本章內(nèi)容小結(jié) 高效液相色譜儀用溶劑作為流動(dòng)相，需要的樣品是液態(tài)的，溶劑的選擇范圍也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了載氣，操作基本上可以在室溫的條件下完成，比較適合自然狀態(tài)下大多數(shù)樣品的分析。 第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)膬上嗪推渌僮鲄?shù) ,多組分混合物樣品在色譜系統(tǒng)中可以實(shí)現(xiàn)分析。 ，發(fā)現(xiàn)故障，指示故障源和發(fā)出報(bào)警信號(hào)，停機(jī)。 。 第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 計(jì)算機(jī)化的色譜儀有如下優(yōu)點(diǎn)： 。 （ 2）數(shù)據(jù)計(jì)算機(jī)輸出、打印記錄。 （ 3）濃度上限監(jiān)視。 （ 1）分析器異常：保留時(shí)間、基線異常、重復(fù)性不良、不能校準(zhǔn)、校正系數(shù)異常、氫焰滅火、載氣壓力下降、標(biāo)準(zhǔn)氣斷、過(guò)壓和溫度過(guò)高等。 自動(dòng)標(biāo)定保留時(shí)間、死時(shí)間、峰高等基本參數(shù)。 第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 內(nèi)部電池支撐內(nèi)存保存，磁盤的輸入、輸出。 第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 可以進(jìn)行總和校正、成分比率、移動(dòng)平均，線性多項(xiàng)式演算等數(shù)據(jù)計(jì)算。 第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 圖 529 色譜界面 第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 二、微機(jī)在色譜儀中的功能 峰檢測(cè)方式有：①峰處理方式：波形處理、基線校正、不完全分離成分的分離、拖尾峰上峰的分析、線性化；② 計(jì)算峰高；③峰面積積分。軟件部分主要有系統(tǒng)、控制、采樣軟件和各種數(shù)據(jù)處理軟件包。 第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 微機(jī)的發(fā)展使積分儀已漸被色譜數(shù)據(jù)處理站（ chromatographic data system）取代。在色譜分析時(shí)，被分析物的濃度和含量通常與峰面積存在線性關(guān)系。 第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 積分儀主要有兩種：模擬和數(shù)字積分儀。但保留時(shí)間、峰高、峰面積等參數(shù)需要人工的方式來(lái)處理。 第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 是目前用得比較廣泛的一種裝置。最基本的方式是繪出色譜圖。一般隨著樣品體積的增加，柱效率會(huì)降低。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 高效液相色譜儀主要追求的是分析速度及分離能力，常只允許極小的進(jìn)樣量，這將有利于這兩項(xiàng)指標(biāo)。高壓雖可增加分離速度，但會(huì)帶來(lái)密封、固定相的強(qiáng)度等問(wèn)題。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 高效液相色譜儀分析速度提高的原因之一是采用了高壓。因此在高效液相色譜儀中，一般均通過(guò)流動(dòng)相的選擇而不是柱溫的調(diào)整來(lái)提高分離能力。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有70％以上的分析是在室溫下進(jìn)行的。制備時(shí)，流量可選大一些。應(yīng)根據(jù)樣品的性質(zhì)、樣品量大小、分離目的、選擇的固定相和流動(dòng)相以及色譜柱的尺寸等因素綜合考慮。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 圖 528 二極管陣列檢測(cè)器及其譜圖 第三節(jié) 高相液相色譜儀 五、操作條件的選擇 操作條件的選擇除前面介紹的色譜柱參數(shù)、流動(dòng)相及固定相的選擇外，還包括以下幾點(diǎn)。但它檢測(cè)的樣品必須能夠被激發(fā)出熒光，也是一種選擇性檢測(cè)器。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 熒光檢測(cè)器根據(jù)單色器的不同，分為多波長(zhǎng)熒光檢測(cè)器（由多個(gè)濾光片構(gòu)成單色器）和熒光分光檢測(cè)器（由光柵構(gòu)成單色器）。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 某些物質(zhì)在吸收了一定的光能后，會(huì)發(fā)射出頻率較低、波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光。也不適于梯度洗脫。基本上對(duì)所有被測(cè)對(duì)象均有響應(yīng)，且不破壞被測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)。偏轉(zhuǎn)式的線性范圍較寬，不需換液槽，穩(wěn)定性好，但液槽體積大。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 第三節(jié) 高相液相色譜儀 1 洗脫液、樣品 棱鏡 L2 D 接收系統(tǒng) 底板 樣品槽 參比槽 L M2 投影系統(tǒng) F M1 S 出口 (a)光路圖 洗脫液或樣品 不銹鋼底板 棱鏡 反射光（不用） 來(lái)自光源 L2 接收器 D (b)原理示意圖 圖 526 反射式示差折光檢測(cè)器 （ 2）偏轉(zhuǎn)式示差折光檢測(cè)器： 根據(jù)折射定律， n1sinθ 1 = n2sinθ 2 （ 5－ 9） 折射角 θ 2取決于入射角 θ 1和相分界面上兩種介質(zhì)的折射率 n n2。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 接照作用原理可將示差折光檢測(cè)器分為反射式和偏轉(zhuǎn)式兩種。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 （ RID） 主要由光源系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、接收、放大、記錄系統(tǒng)構(gòu)成。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 紫外及可見(jiàn)光檢測(cè)器是目前高效液相色譜儀中最常用的檢測(cè)器。 ③對(duì)分光后光的單色性、波長(zhǎng)精度要求不高，光譜寬度可在 10nm，波長(zhǎng)精度可以低至 177。 ②檢測(cè)靈敏度達(dá) ～ （光度計(jì)為 ～ .）。紫外分光檢測(cè)器的工作波長(zhǎng)可通過(guò)調(diào)節(jié)棱鏡或光柵來(lái)加以選擇，因而可將檢測(cè)器的工作波長(zhǎng)選擇在吸收系數(shù)較大波長(zhǎng)上，以提高檢測(cè)靈敏度。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 圖 523 紫外檢測(cè)器 第三節(jié) 高相液相色譜儀 圖 524 紫外分光檢測(cè)器 第三節(jié) 高相液相色譜儀 光路 出口 樣品＋洗脫液 樣品＋洗脫液 光路 出口 圖 525 紫外檢測(cè)器樣品池 (a) “ Z ” 型 (b) “ H ” 型 第三節(jié) 高相液相色譜儀 檢測(cè)器可設(shè)計(jì)為單波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器與紫外及可見(jiàn)分光檢測(cè)器兩類。要注意它的樣品池做成細(xì)長(zhǎng)的流動(dòng)型，如 Z型、H型。其具體結(jié)構(gòu)基本與紫外 可見(jiàn)分光光度計(jì)相同。另一類是把從色譜柱流出物的溶質(zhì)和溶劑分開(kāi)，讓溶質(zhì)單獨(dú)進(jìn)入檢測(cè)器，稱為溶質(zhì)性檢測(cè)器。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 目前常用的檢測(cè)器有兩大類，一類是保持溶質(zhì)在溶劑中，即流動(dòng)相加已分離組分直接進(jìn)入檢測(cè)器檢測(cè)，即對(duì)洗脫液和組分總體的物性（如折光率、電導(dǎo)率等）進(jìn)行檢測(cè)。 。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 （三）溫度控制系統(tǒng) 由于高效液相色譜儀的操作約有70％以上可以在室溫的條件下完成，因而對(duì)溫度的要求不象氣相色譜儀那樣嚴(yán)格。 ④對(duì)樣品應(yīng)有選擇性。 ②粘度應(yīng)盡可能小。 反向分離是指用非極性固定液和極性流動(dòng)相來(lái)分析非極性化合物的色譜系統(tǒng)，非極性的樣品與固定液有很好的相互作用，它的保留就比極性強(qiáng)。有正向分離和反向分離兩種分離形式。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 液液分配色譜法與氣液分配色譜法一樣，也是在擔(dān)體（載體）上涂敷一層固定液作為固定相。 ⑤粘度要小一些。 ③能溶解待分離樣品。主要是指柱效率或柱子的保留性質(zhì)要長(zhǎng)期不變。這也是液相色譜法比氣相色譜法優(yōu)越的條件之一。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 由于可用作流動(dòng)相的溶劑很多，不同溶劑的性質(zhì)（包括極性、濃度、 pH值、粘度等）均有較大的差異。有等比重、非等比重兩種。 干裝法適用于粒度＞ 20μm 的固定相顆粒的填充。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 柱管的填充主要根據(jù)固定相的粒度大小分別采用干裝法和濕裝法。從結(jié)構(gòu)上看，吸附劑可以分為全多孔型及表面多孔型（或稱薄殼型）兩類。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 第三節(jié) 高相液相色譜儀 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 圖 522 色譜柱 1－不銹鋼管柱 2， 7－螺帽 3， 9－壓圈 4， 8－密封圈 5－不銹鋼過(guò)濾片 接頭 10－細(xì)不銹鋼管 （二）固定相和流動(dòng)相 固定相都是一些吸附活性強(qiáng)弱不等的吸附劑，所用的吸附劑大部分以硅膠為基體。 要求柱管內(nèi)壁經(jīng)拋光處理，內(nèi)徑上下一致，以免引起流量變化?，F(xiàn)在基本上都采用直管柱。工作壓力超過(guò) ，必須用不銹鋼管柱。為達(dá)到好的分離效果，色譜柱的選擇尤為重要。它承擔(dān)著樣品的分離，是色譜儀最重要的部件之一。但要求進(jìn)樣器盡量保持原壓力，以利于進(jìn)樣完后壓力的迅速恢復(fù)。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 圖 521 自動(dòng)進(jìn)樣器 第三節(jié) 高相液相色譜儀 以上兩種方法均是在流動(dòng)相保持流動(dòng)的情況下進(jìn)樣，稱為不停流進(jìn)樣。但由于在高效液相色譜儀中是在高壓的條件下進(jìn)樣，因而對(duì)其承受高壓的能力和密封性要求更嚴(yán)格。有四通、六通閥等。工作壓力可達(dá) 。它在不進(jìn)樣時(shí)用隔斷器將進(jìn)樣系統(tǒng)與流動(dòng)相隔斷開(kāi)。但對(duì)隔膜、彈性墊片要求耐壓高，一般在壓力低于。進(jìn)樣時(shí)注射器直接插入色譜柱上端的進(jìn)樣器隔膜，將樣品注入到色譜柱中固定相的頂端?？煞譃橹苯幼⑸淦鬟M(jìn)樣與隔斷式注射器進(jìn)樣兩種。為適應(yīng)高壓條件下進(jìn)樣，進(jìn)樣方式又有停流動(dòng)相和不停流動(dòng)相進(jìn)樣兩種方式。否則，柱效率將受到損失。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 二、進(jìn)樣系統(tǒng) 高效液相色譜儀的進(jìn)樣系統(tǒng)，要求能將樣品有效地注入到系統(tǒng)里去，而不破壞在色譜柱和檢測(cè)器里所建立的流量平衡。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 第三節(jié) 高相液相色譜儀 圖 519 梯度洗脫裝置原理示意圖 液 A 比例閥 A 液 B 比例閥 B 混合器 高壓泵 色譜柱 液 A 泵 A 液 B 泵 B 混合器 色譜柱 (a)外梯度洗脫 (b)內(nèi)梯度洗脫 （三）流量控制器 高壓的流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱時(shí)，與固定相產(chǎn)生相互作用，固定相會(huì)形成一個(gè)與流動(dòng)相流動(dòng)方向相反的作用力，即構(gòu)成一個(gè)與流向相反的壓力，稱之為柱反壓，它將阻礙流動(dòng)相的正常流動(dòng)。其目的是讓樣品每個(gè)組分都在最佳分配系數(shù)的條件下分離出來(lái)，以獲得較好的峰形。 。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 。而最后出來(lái)的若干組分因時(shí)間太長(zhǎng)，峰形擴(kuò)散，致使檢測(cè)器的靈敏度顯著降低，甚至無(wú)法檢出。常液洗脫是在樣品分離過(guò)程中從始至終采用相同的流動(dòng)相和相同的流量，在樣品各組分 K值分布范圍不是很寬時(shí)，可得到較好的分離效果。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 （三）梯度洗脫及洗脫方式 控制高效液相色譜儀流動(dòng)相的有常液洗脫（ isocratic elution）和梯度洗脫兩種方式。在工作過(guò)程中，如果有管道堵塞或流量過(guò)大等原因造成壓力過(guò)高而不能監(jiān)測(cè)出來(lái)，就可能造成儀器有關(guān)部件的損壞。 （ 3）采用更合理的驅(qū)動(dòng)凸輪幾何形狀設(shè)計(jì)方案。 （ 1）可通過(guò)采用多頭泵交替工作。 第三節(jié) 高相液相色譜儀 出 口 入 口 單 向 閥 液缸 柱塞 凸輪