【正文】 第五章 色譜分析技術(shù)和色譜分析儀器 色譜儀器是近幾十年來迅速發(fā)展起來的一類新型分離分析儀器，主要用于復(fù)雜的多組分混合物的分離、分析。 本章將系統(tǒng)介紹有關(guān)色譜儀器的原理、結(jié)構(gòu)和使用。 第五章 色譜分析技術(shù)和色譜分析儀器 第一節(jié) 色譜法概述 第二節(jié) 氣相色譜儀 第三節(jié) 高效液相色譜儀 第四節(jié) 色譜儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 第五章 色譜分析技術(shù)和色譜分析儀器 目 錄 引言 本章內(nèi)容小結(jié) 色譜法（ chromatography）是一種物理分離技術(shù)，實(shí)質(zhì)上是利用混合物中各個(gè)組分在互不相溶的兩相（固定相和流動相）之間的分配的差異而使混合物得到分離的一種方法，也有人稱之為色層法、層析法等。 第一節(jié) 色譜法概述 引 言 色譜儀（ chromatograph）的實(shí)質(zhì)是利用色譜分離技術(shù)再加上檢測技術(shù)，對混合物進(jìn)行先分離后檢測，從而實(shí)現(xiàn)對多組分的復(fù)雜混合物進(jìn)行定性、定量分析。 第一節(jié) 色譜法概述 色譜分離中的兩相是指系統(tǒng)具有一個(gè)有大比表面積的固定相（ stationary phase）（可以是固體或以某種方式固定了的液體）和一個(gè)能攜帶待分離混合物流過固定相的所謂流動相（ mobile phase）（可以是氣體或液體）。 第一節(jié) 色譜法概述 色譜工作就是根據(jù)被測樣品（混合物）的性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)膬上嗪推渌僮鳁l件，利用分離系統(tǒng)將各個(gè)組分分離開來，通過檢測系統(tǒng)進(jìn)行定性、定量分析。具有高分辨率、高靈敏度、樣品量少且速度較快、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，是分析混合物的有效方法。 第一節(jié) 色譜法概述 第一節(jié) 色譜法概述 目 錄 一、色譜法的研究進(jìn)展 二、色譜分離的基本原理 三、色譜儀的分類及特點(diǎn) 四、色譜儀的輸出信息 五、色譜技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用 一、色譜法的研究進(jìn)展 1903年至 1906年俄國植物學(xué)家茨維特（ Tswett）首先利用分離及分析技術(shù)進(jìn)行植物色素方面的研究， “ 色譜 ” 因此而得名。 1931年，文特斯汀（ Winterstein)開始將這種分離技術(shù)應(yīng)用于無色物質(zhì)的分離。 第一節(jié) 色譜法概述 1952年，馬丁（ Martin）等人提出了氣液（分配）色譜法，正式推出了氣相色譜技術(shù)，為色譜技術(shù)及色譜儀的發(fā)展開辟了廣闊的前景。在 50年代～ 60年代，氣相色譜儀的發(fā)展速度幾乎居各類分析儀器的首位。 第一節(jié) 色譜法概述 液相色譜技術(shù)的發(fā)展相當(dāng)緩慢。直到 60年代初，由于高壓技術(shù)、高效固定相、檢測技術(shù)的發(fā)展以及電子、計(jì)算機(jī)技術(shù)等方面的新成就的不斷涌現(xiàn)，才給液相色譜技術(shù)及液相色譜儀的發(fā)展創(chuàng)造了有利條件，使它在 70年代迅速發(fā)展起來。 第一節(jié) 色譜法概述 目前氣相色譜儀和液相色譜儀都已發(fā)展成熟廠家在生產(chǎn)此類儀器，應(yīng)用也十分普遍。 采用微處理器自動控制可以通過鍵盤操作完成色譜條件的設(shè)定、控制和對儀器工作狀態(tài)的監(jiān)控，色譜輸出信息也可通過接口電路送入計(jì)算機(jī)進(jìn)行計(jì)算、標(biāo)定、測量與分析，最后用打印機(jī)等輸出設(shè)備給出需要的結(jié)果。 第一節(jié) 色譜法概述 色譜儀的聯(lián)用技術(shù)也越來越受到廣泛的重視，如氣相色譜儀和質(zhì)譜儀的聯(lián)用已十分普及，液相色譜儀與質(zhì)譜儀的聯(lián)用也在不斷發(fā)展。微機(jī)化和聯(lián)用技術(shù)在目前的色譜儀中既已普遍采用又在不斷向縱深發(fā)展。 第一節(jié) 色譜法概述 在氣相色譜儀中，除常用的填充柱氣相色譜儀外，由于毛細(xì)管柱尤其是大口徑毛細(xì)管柱的發(fā)展，毛細(xì)管柱氣相色譜儀由于其強(qiáng)大的分離效能也得到了越來越普遍的應(yīng)用。 第一節(jié) 色譜法概述 在液相色譜儀中，用得最多的還是高效液相色譜儀，但隨著生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)科的發(fā)展，制備型液相色譜儀、低壓液相色譜儀、超臨界流體色譜儀（特別是毛細(xì)管超臨界流體色譜儀）、膜色譜技術(shù)、離子色譜儀也在不斷研究、開發(fā)和應(yīng)用。 第一節(jié) 色譜法概述 二、基本原理 色譜是利用待分離的樣品組分在兩相中分配的差異而實(shí)現(xiàn)分離的。 第一節(jié) 色譜法概述 第一節(jié) 色譜法概述 檢測器 色譜柱（固定相） 樣品組分 1＋ 2＋ 3 流動相 流動相 流動相 流動相 流動相 流動相 時(shí)間（ t） 響應(yīng)R 圖 色譜分離原理示意圖 進(jìn)樣峰 1 2 3 1 1 2 2 2 3 3 3 3 由此可見，色譜分離的兩要素是互不相溶的兩相（流動相及固定相）以及樣品（混合物）各組分在兩相中分配的差異，它是決定色譜最終分離結(jié)果好壞的基礎(chǔ)。 第一節(jié) 色譜法概述 三、色譜儀的分類及其特點(diǎn) 目前比較成熟的主要是氣相色譜儀與液相色譜儀（高效液相色譜儀）兩大類。儀器的組成極為相似，主要由流動相供給、進(jìn)樣、分離（色譜柱）、檢測、數(shù)據(jù)處理記錄、溫度控制和其他控制系統(tǒng)等組成。 第一節(jié) 色譜法概述 氣相色譜儀具有高分辨率、高速度、高靈敏度及選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。但只能用于被氣化物質(zhì)的分離、檢測，而常壓下可氣化或可定量轉(zhuǎn)變?yōu)闅饣难苌锏奈镔|(zhì)，其總的比例大約只占幾百萬種化合物的 20％左右。大部分物質(zhì)不能被氣化，因而也就不能用氣相色譜法。 第一節(jié) 色譜法概述 液相色譜的樣品無需氣化而直接導(dǎo)入色譜柱進(jìn)行分離、檢測，特別適用于氣化時(shí)易分解物質(zhì)的分離、分析。約有70％左右的有機(jī)物能分析。通常認(rèn)為有機(jī)物質(zhì)分子量＜ 400時(shí)，用氣相色譜儀；在 400～ 1000時(shí)，最好用高效液相色譜儀；＞ 1000時(shí)用凝膠色譜 (排阻色譜 )。 第一節(jié) 色譜法概述 根據(jù)色譜分離的基本原理可以看出：色譜儀的主要特點(diǎn)是可以對混合物進(jìn)行多組分分析或全分析。儀器結(jié)構(gòu)簡單，操作使用方便，具有應(yīng)用范圍廣、樣品用量少、高選擇性、高效能、高速度以及高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。 第一節(jié) 色譜法概述 （ 1）應(yīng)用范圍廣是指色譜儀可用于所有化合物的分離和分析，既能對有機(jī)物、無機(jī)物、低分子或高分子化合物，又能對有生物活性的生物大分子分離和測定。 （ 2）樣品用量少是指色譜儀用極少的樣品就能完成一次分離及分析，進(jìn)而可以實(shí)現(xiàn)痕量分析、微量分析。 第一節(jié) 色譜法概述 （ 3）高選擇性是指對性質(zhì)極為相近的物質(zhì)，如同位素、同分異構(gòu)體等，通過選取適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗉傲鲃酉嗪头蛛x條件，可實(shí)現(xiàn)分離及分析。 （ 4）高效能是指色譜分析能夠分析分配系數(shù)極為接近的組分，從而可分離并分析極為復(fù)雜的混合物。 第一節(jié) 色譜法概述 （ 5）高靈敏度是指色譜儀能分析含量極微的物質(zhì)，如氣相可檢出 1011g～ 10– 13g物質(zhì)。液相也接近此精度。 （ 6）色譜儀的分析速度較快，只需幾分鐘至幾十分鐘就可完成一個(gè)樣品的分析工作。 第一節(jié) 色譜法概述 與光譜儀、質(zhì)譜儀等分析儀器相比較，色譜儀的突出優(yōu)點(diǎn)是對多組分混合物分離、分析能力較強(qiáng)，其分析靈敏度與質(zhì)譜儀接近，比光譜儀高。而且造價(jià)低，使用方便。 第一節(jié) 色譜法概述 色譜儀最大的不足之處是難于分析未知物。因此，可以將其與光譜儀、質(zhì)譜儀聯(lián)合起來使用，優(yōu)勢互補(bǔ)，形成色譜 光譜法、色譜 質(zhì)譜法聯(lián)用技術(shù)，再配備上微機(jī)進(jìn)行自動控制與信息處理。多機(jī)聯(lián)用與微機(jī)化、自動化是現(xiàn)代分析儀器發(fā)展的重要趨勢。 第一節(jié) 色譜法概述 四、色譜儀的輸出信息 （ chromatogram） 表明已被色譜柱分離的物質(zhì)流過檢測器的含量與時(shí)間的關(guān)系。 第一節(jié) 色譜法概述 圖 色譜圖 檢測器的響應(yīng)R 基線 b 進(jìn)樣峰 進(jìn)樣峰a 進(jìn)樣峰h 1 2 3 時(shí)間 t(min) tRa tR1 tR2 tR3 第一節(jié) 色譜法概述 （ base line） 是圖中與時(shí)間軸平行 t的記錄線 b。它表明純流動相流過檢測器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)。判斷基線穩(wěn)定與否的標(biāo)準(zhǔn)是基線穩(wěn)定性，即基線 b與時(shí)間軸 t平行或偏離的程度。 第一節(jié) 色譜法概述 檢測器的輸出信號隨流入組分的濃度或質(zhì)量的變化出一個(gè)個(gè)的峰形，即為色譜峰（ chromatographic peak）。色譜峰所包圍的面積稱為峰面積，是色譜定量分析的基礎(chǔ)。色譜峰最高點(diǎn)至峰底的垂直距離稱為峰高（ peak height)h。 第一節(jié) 色譜法概述 進(jìn)樣峰（ injection peak）是進(jìn)樣時(shí)操作條件被干擾出現(xiàn)的，也可在進(jìn)樣時(shí)通過連動裝置進(jìn)行標(biāo)記，是色譜分離過程中時(shí)間的起點(diǎn)?？諝夥澹?air peak）是由于空氣等物質(zhì)不被固定相吸收，最先被流動相沖洗出來到達(dá)檢測器而形成的峰形。 第一節(jié) 色譜法概述 從進(jìn)樣開始到出現(xiàn)色譜峰最大值所需的時(shí)間為保留時(shí)間（ retention time）。常用 tR（組分名） （或簡寫為 tR）表示，如 tR tR2等，單位為 min。與保留時(shí)間有關(guān)的其他參數(shù)，如保留體積、校正保留時(shí)間等，統(tǒng)稱保留參數(shù)。 第一節(jié) 色譜法概述 死時(shí)間（ dead time）是指惰性物質(zhì)組分，從注入到出現(xiàn)峰的最高點(diǎn)所需時(shí)間，若組分是空氣，用符號 t0表示，單位為 min。死體積（ dead volume）指色譜柱內(nèi)流動相的體積，在實(shí)際中包括從進(jìn)樣系統(tǒng)到檢測器的體積。 第一節(jié) 色譜法概述 五、色譜技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用 氣相色譜儀常用于人體微量元素的快速分析，血與尿等體液中的脂肪酸、氨基酸、甘油三酸酯、甾族化合物、糖類、蛋白質(zhì)、維生素、巴比妥酸等化合物的分析，分析鑒定藥物的組成和含量、檢測人體的代謝產(chǎn)物，通過氣相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜，在 “ 興奮劑 ” 檢測中可分析100余種違禁藥品等。 第一節(jié) 色譜法概述 高效液相色譜儀可以應(yīng)用在：分析人體體液內(nèi)正常與異常代謝物質(zhì)；分析藥物的組成和含量，在藥物生產(chǎn)中進(jìn)行中間控制；分析藥物在體內(nèi)的殘留量，測定藥物在各器官中的代謝產(chǎn)物，進(jìn)行治療藥物效果的監(jiān)測（治療藥物檢測 )；定性測定細(xì)胞核中的核苷及核苷酸，分析核酸以及分析氨基酸、酶、糖；激素水平的測定，微生物的鑒定等。 第一節(jié) 色譜法概述 一臺典型的氣相色譜儀主要由氣路系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng) (色譜柱 )、檢測系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理、記錄系統(tǒng)及電源、電子線路等構(gòu)成。 第二節(jié) 氣相色譜儀 國產(chǎn)氣相色譜儀 第二節(jié) 氣相色譜儀 國外產(chǎn)氣相色譜儀 載氣源 減壓