【正文】 定量基礎(chǔ)：試液在兩個波長下的吸 光度差值與待測組分的濃度成正 比。 定量基礎(chǔ)：相對吸光度與濃度差成正 比。 吸光度的加和性： 如果兩個組分的吸光質(zhì)點對某一波長 的單色光均有吸收作用，而且這兩種 吸光質(zhì)點之間相互不發(fā)生化學(xué)作用，當(dāng) 用單色光通過此溶液時，從理論和實驗 都可證明，溶液的總吸光度等于各組分 的吸光度之和。 （二）介質(zhì)的不均勻性 不均勻的介質(zhì)主要包括： （ 1）待測試液是膠體溶液； （ 2）待測試液是乳濁； （ 3）待測試液有懸浮物。 測量的吸光度最好在： 范 圍內(nèi) 第五節(jié) 朗伯 比耳定律的偏離 一、非單色光引起的偏離 朗伯 比耳定律只適用于單色光， 單色光的純度與儀器的質(zhì)量有關(guān)，性能 好的分光光度計，所得的入射光的波長 范圍較窄，即“單色光”純度較高，標(biāo)準(zhǔn) 曲線的線性范圍也大。 五、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 配制一系列不同含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分 別置于比色皿內(nèi)，選擇合適的入射光 波長，用參比溶液調(diào)整光度計的零 點，然后把入射光照射到盛有標(biāo)準(zhǔn)溶 液的比色皿上，測得吸光度值。 （ 3）如顯色劑有顏色，則要用 試劑空白 （不加試樣溶液） 作參比溶液。 四、參比溶液的選擇 （ 1）當(dāng)試液本身及顯色劑均無色，可用 蒸鎦水 作參比溶液。 三、分析波長的選擇 （ 1）如果不存在其它有色物質(zhì)的干 擾，則選擇待測有色物（或顯色 劑生成的產(chǎn)物）的最大吸收波長 的光波作為入射光進(jìn)行光度測 定。 （ 3）與待測離子形成更穩(wěn)定的絡(luò)合。 （六）干擾物質(zhì)的影響及消除方法 （ 1）干擾物質(zhì)本身有顏色或與顯色劑 形成有色化合物，在測量條件下 也有光吸收。 （四）溫度 大多數(shù)的顯色反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，但有些顯色反應(yīng)必須加熱至一定的溫度和一定時間才能完成。 （二）顯色劑用量 為了使顯色反應(yīng)進(jìn)行完全，需加入過量 顯色劑，在實際工作中，通常根據(jù)試驗 來確定。 （ 2）生成的有色化合物有較高的摩爾吸光 系數(shù)，靈敏度足夠高，適用于試樣中 待測物質(zhì)的含量范圍。 應(yīng)用 : 單一組分測定示例 、 多組分測定 、 光度滴定 、絡(luò)合物組成的測定 、 酸堿離解常數(shù)的測定 。 靈敏度的表示 —摩爾吸光系數(shù)的意義和計算 ； 準(zhǔn)確度 —適宜的測量范圍 、 偏離比爾定律的原因 。 定量分析的基礎(chǔ) —朗伯 比爾定律： A=?bc=lgT 式中 各參數(shù)的物理意義 ， 定量計算 。 Co(III)與 3， 5－二氯－ PADAT的比值為 1:2 平衡移動法 固定 [M],不斷改變 [L]， 以 lg[MLn]/[M]為縱坐標(biāo) ，lg[L]為橫坐標(biāo) ， 作圖 ， 斜率 n即是絡(luò)合物中 L:M的比值；縱軸上的截距 lgK是絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù) 。 HB ＝ H+ + B [H+][B] Ka = [HB] pKa=pH+ lg [HB] [B] A=AHB+AB pKa=pH lg AHB A A AB lg A HB A A AB 對 pH作圖即可求得 pKa P133(530)： 4. 絡(luò)合物組成確定 飽和法（摩爾比法） 制備一系列含釕 105 mol/L (固定不變 )和不同濃度（小于 105 mol/L）的 PDT溶液，按實驗條件， 485nm測定吸光度 ,作圖。 2. 多組分的測定 ?x?1, ?y?1, ?x?2, ?y?2由 x,y標(biāo)液 在 ?1, ?2處分別測得 a) 在 ?1處測組分 x, 在 ?2處測組分 y b) 在 ?1處測組分 x。 對朗伯 比爾定律的偏移 非均勻介質(zhì) 膠體，懸浮、乳濁等對光產(chǎn)生散射，使實測吸光度增加，導(dǎo)致線性關(guān)系 上彎 2 物理化學(xué)因素 離解、締合、異構(gòu)等 如： Cr2O72+H2O=2HCrO4 =2H++2CrO42 PAR的偶氮－醌腙式 化學(xué)反應(yīng) 吸光度標(biāo)尺刻度不均勻 吸光度測量的誤差 dc/c= dA/A=dT/(TlnT) Er=dc/c 100％ = dA/A 100％ =dT/TlnT 100％ P326 P327 10 8 6 4 2 0 20 40 60 80 A T% Er r0. 43 4lg( 0. 01 )cTEc T TT??????() 濃度測量的相對誤差Er與T(或 A)的關(guān)系 實際工作中，應(yīng)控制 T在 15%～ 65％ , A在 ～ (調(diào) c, b, ?)， 相對誤差 4% 目的：提高光度分析的準(zhǔn)確度和精密度 解決高 (低 )濃度組分 (A在 ~ )問題 分類：高吸光度差示法、低吸光度差示法、 精密差示吸光度法 特點： 以標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比溶液 原理： A相對 = ?A = ?bcx ?bc0= ?b?c 準(zhǔn)確度：讀數(shù)標(biāo)尺擴(kuò)展 , 相對誤差減少 c0愈接近 cx, 準(zhǔn)確度提高愈顯著 結(jié)果計算： cx = c0 +?c 常用的吸光光度法 例： 用普通分光光度法測得標(biāo)液 C1的透光率為 20%，試液的透光率為 12%，若以示差法測定，以 C1為參比，則試液的透光率為 A. 40% % % % 答案： % 1. 單一組分測定 1) 金屬離子 : Fephen, Ni丁二酮肟 , Co鈷試劑 2) 磷的測定 : DNA中含 P～ %, RNA中含 P～ %,