[自然科學(xué)]分子克隆(參考版)
2024-10-22 03:34本頁(yè)面
【正文】 許多情況下，可以通過(guò)免疫分析方法來(lái)證實(shí)是否有以前鑒定的 DNA結(jié)合蛋白存在。但是在少數(shù)情況下，復(fù)合物的蛋白組分帶有很強(qiáng)的負(fù)電荷或正電荷，可能需要用酸性 (如 TAE, pH6 . a )或堿性的緩沖液 (如 50 mrnol/L TrisHCl，甘氨酸， )。因?yàn)榄傊悄z的孔徑很大，不能檢測(cè)蛋白引起的 DNA彎曲。 短一些的 DNA一般用 10%聚丙烯酞胺凝膠。一般來(lái)說(shuō)，構(gòu)象引起的效應(yīng)有以下性質(zhì) :電泳分析 DNA復(fù)合物時(shí)，低溫、有 Mg2+存在以及凝膠的孔徑比較小都會(huì)增大這種效應(yīng)。引起彎曲的角度越大，遷移率的減少的越大。 ? 當(dāng)?shù)鞍捉Y(jié)合引起 DNA片段的彎曲，遷移率就會(huì)發(fā)生更大的偏差。 ? 如果結(jié)合蛋白是高酸性的而且?guī)Ш軓?qiáng)的負(fù)電荷，那么復(fù)合物的遷移率可能與裸 DNA沒(méi)有明顯的差異。復(fù)合物的遷移率與游離蛋白的大小有關(guān)。 ? （ 4℃ 條件下 810伏 /cm，電泳 2～ 3 小時(shí) ） ? 6 顯影、掃圖 ? 在暗室中將磷屏固定在凝膠上方；使用磷屏壓片 24小時(shí)， 掃圖 ? 影響蛋白一 DNA復(fù)合物在凝膠中的遷移率有 3個(gè)主要因素 : ? 蛋白 DNA復(fù)合物的分子量、它們的總電荷及復(fù)合物中DNA的構(gòu)象 。 ? 探針的純化 3000rpm離心 Sephadex G50 柱子，以除去 G50柱子中的 Buffer； ? EP管放置 G50柱子，并在 EP管中加入30μl水； ? Sephadex G50 柱子， 3000rpm，離心 2分鐘；（ G50柱子能吸附單核苷酸，通過(guò)柱子離心到 EP管中的就是標(biāo)記好的探針） ? CPM(放射性比活度 )； ? 20℃ ? 4,測(cè)定探針的放射活性 取 1ul純化的探針，用閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)量其放射活性，放射活性大于 1* 10 5cpm/ul示標(biāo)記成功。 37℃ 水浴 30分鐘 。 ④ T4多聚核甘酸激酶 :lul (10U)。② 10 x激酶緩沖液 :2u1。 ? A、探針的標(biāo)記 :將以下試劑加入冰浴中的 l的 EP管中，總體積 20ul時(shí)。 ? ⑤加與細(xì)胞等體積的冰浴緩沖液 B，充分混勻，冰上放置30min后，于 40℃ ,15 000g離心 15min,上清為核蛋白。 ? ②將細(xì)胞用冰冷 PBS洗兩遍，于 4℃ , 5000g離心 3min，沉淀細(xì)胞。包括：標(biāo)記特異性探針，非特異性競(jìng)爭(zhēng)探針，未標(biāo)記特異性競(jìng)爭(zhēng)探針 ? 與結(jié)合蛋白特異性結(jié)合抗體，非特異性結(jié)合抗體。 ? 制備同位素標(biāo)記的 DNA或 RNA。這一技術(shù)最初用于研究 DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究 RNA結(jié)合蛋白和特定的 RNA序列的相互作用。通過(guò)加入合理量的非放射性標(biāo)記探針進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，可以完全使放射性標(biāo)記探針形成不了復(fù)合體，從而檢驗(yàn) DNA結(jié)合的特異性。在競(jìng)爭(zhēng)的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點(diǎn)和強(qiáng)度來(lái)確定特異結(jié)合。 ? DNA結(jié)合反應(yīng)的蛋
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