專題三核酸電泳技術(shù)(參考版)
2025-05-13 22:20本頁面
【正文】 ?注意個(gè)人防護(hù)。 否則凝膠在含溴化乙錠()的電泳緩沖液中室溫浸染 30～ 45min， 或者用電泳緩沖液 1： 10 000稀釋的 SYBRGold貯備液浸染 。 ? 當(dāng) DNA樣品或染料在凝膠中遷移了足夠距離時(shí) ， 關(guān)上電源 、拔出電極插頭和打開電泳槽蓋 。 待溴酚藍(lán)和二甲苯氰 FF遷移到適當(dāng)距離后再停止電泳 。 給予 1～ 5V/cm的電壓 ， 其中距離以陽極至陰極之間的測(cè)量為準(zhǔn) 。 ? 關(guān)上電泳槽蓋 ， 接好電極插頭 。 ? 用微量移液器及一次性吸頭 ， 將樣品混合液緩慢加至浸沒凝膠的加樣孔內(nèi) 。 切忌將加樣孔加得太滿 ， 甚至溢出 。 能加樣的最大體積是由加樣孔容積決定的 。分析單一 DNA樣品 ， 如 λ噬菌體或質(zhì)粒 DNA， 每個(gè) 5mm寬加樣孔可加 100500ngDNA。 若一個(gè) 5mm寬條帶含有 500ng以上的 DNA時(shí) ， 說明加樣孔過載 ， 會(huì)導(dǎo)致拖尾和模糊不清等現(xiàn)象 。 溴化乙錠染色的凝膠圖像可以觀測(cè)到的最小量 DNA在 5mm寬 (通用加樣孔寬度 )條帶中為 2 ng。 ? 混合 DNA樣品和 6 載樣緩沖液 。 輕輕撕去封邊膠帶 ， 將凝膠安放到電泳槽內(nèi) 。 加少量電泳緩沖液于凝膠頂部 ， 小心拔出梳子 。 需檢查在梳齒下或梳齒間應(yīng)無氣泡 。 ? 澆灌溫?zé)岬沫傊侨芤哼M(jìn)入模具 。 樣品液將從凝膠和加樣孔之間泄漏 。 多數(shù)凝膠托盤都有適宜放梳子的側(cè)壁或外側(cè)支架 。 ? 瓊脂糖溶液正在冷卻時(shí) ， 用一個(gè)合適的梳子形成加樣孔 。 待熔化的凝膠稍冷卻后加入溴化乙錠 ， 終濃度為 。 要查看煮沸后是否由于蒸發(fā)而溶液體積減少 ， 如有必要用水恢復(fù)原體積 。 通常未溶解的瓊脂糖呈小透明體或半透明碎片懸浮在溶液中 。 警惕：微波爐加熱過長(zhǎng) ， 瓊脂糖溶液會(huì)變得過熱或劇烈沸騰 。 ? 根據(jù)欲分離 DNA片段大小用電泳緩沖液配制適宜濃度瓊脂糖溶液：應(yīng)準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉加到盛有定好量的電泳緩沖液的三角燒瓶或玻璃瓶中 。 ? 配制足量的電泳緩沖液 (1 TAE或 TBE)用以灌滿電泳槽和配制凝膠 配膠和灌滿電泳槽使用同一批緩沖液很重要 。由于 SYBR Gold對(duì)熒光敏感 ， 所以其工作液 (1： 10 000稀釋的貯存液 )應(yīng)該當(dāng)天用電泳緩沖液新鮮配制 ， 室溫存放 。 不能將 SYBR Gold加入熔化的凝膠中或電泳前加入凝膠 ， 這是由于在 SYBRGold存在的情況下 ， 凝膠中核酸的電泳條帶會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重變形 。 其發(fā)射的熒光波長(zhǎng)為 537nm。 SYBRGold染料的最大激發(fā)波長(zhǎng)為 495nm。 因此用 SYBRGold染色可以檢測(cè)出瓊脂糖凝膠中小于 20pg的雙鏈 DNA(是 EB染色最低檢測(cè)量的1/25)。 其與 DNA結(jié)合的親和力高 ， 并且結(jié)合后 ， 能夠極大的增強(qiáng)熒光信號(hào) 。 由于熒光的亮度與DNA的含量成相關(guān) ， DNA的含量可通過樣品在 590 nm處的光量度與一系列標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)照來估算 。 但是在檢測(cè)小量 DNA(10 ng)片段時(shí) ，通常要將染色后的凝膠浸入水中或
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