【正文】 。我對導師的感激之情溢于言表，在此，謹向恩 師衷心道一聲：謝謝 ! 感謝昆山正興食用菌有限公司 提供研究菌種和條件。導師淵博精深的學識才華、嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度、兢兢業(yè)業(yè)的科研精神、廣博的氣度胸襟以及為人師表的學者風范使我受益匪淺。從試驗設(shè)計到試驗具體工作以至論文的撰寫，每一步都凝聚著導師的心血。 表 13 抑菌劑隨時間的效果變化 抗生素 菌株 0h 1h 2h 菇保 S1 7 13 10 10 5 S2 8 15 17 10 5 甲酚皂 S1 2 1 S2 8 常熟理工學院畢業(yè)設(shè)計（論文） 22 苯扎溴銨消毒液 S1 11 3 S2 7 注：抑菌圈直徑單位為 mm。如圖 。 經(jīng)檢驗發(fā)現(xiàn)，其中高錳酸鉀（濃度為 1%、 %、 %、%）均對菌株 S S2 無作用，其余 3 種抗生素對病原細菌的抑制作用均有較好的相關(guān)性（見表 11），相關(guān)系數(shù) 之間；大部分藥劑均屬于敏感水平，抑菌圈大小順序依次為：菇保 苯扎溴銨消毒液 甲酚皂。結(jié)果見表 、 。參照上述細菌分類鑒定手冊對假單胞菌的鑒定方法，進行了其他生理生化試驗，并和 Pseudomonas 的細菌進行比較，結(jié)果見表 表 菌株 S2 的生理生化測定結(jié)果 實驗項目 S2 pv. marginalis pv. pastinacae 氧化分解葡萄糖 + / / 常熟理工學院畢業(yè)設(shè)計（論文） 18 氧化酶 + + + 接觸酶 + + + 精氨酸雙水解酶 + + + 還原硝酸鹽反應(yīng) + + + 明膠液化 + + + 乙醇氧化 / / 碳源的利用 D葡萄糖 + + + D蔗糖 + + + D甘露醇 棉子糖 + + L丙氨酸 + / / 生長溫度 41℃ + + + 4℃ 產(chǎn)生吲哚試驗 / / 反硝化作用 / / 淀粉水解 / / 乙酰甲基甲醇試驗（ ） / / 甲基紅試驗（ ） / / 硫化氫產(chǎn)生 / / 水解 七葉靈 / / 厭氧生長 / / 卵磷脂酶測定 / / 注： + 表示反應(yīng)為陽性； 表示反應(yīng)為陰性； d 表示 1189 菌株為陽性； / 表示沒有數(shù)據(jù)報道 從表中可以看出，菌株 S2 生理生化實驗結(jié)果和 邊緣 假單胞菌 (） 基本一致，結(jié)合細胞形態(tài)、革蘭氏染色、運動狀態(tài)、 16S rDNA 等情況，斷定菌株 S2 為一株 邊緣 假單胞菌 (） 。 菌株 S2 的生理生化特征 常規(guī)生理生化測試表明，菌株 S2 氧化利用葡萄糖，不能發(fā)酵葡萄糖乙醇產(chǎn)酸，接觸酶 和 氧化酶 均為陽性 。參照《伯杰氏 細菌鑒定手冊 第八版》和《常見細菌鑒定手冊》[7,9]，斷定菌株 S1 為假單胞菌屬的細菌。在培養(yǎng)基培養(yǎng) 24h， CTE722B為半透明、淡黃色的圓形菌落，表面隆 起，邊緣略粗糙； CTE722C 為半透明、乳白色的圓形菌落，邊緣整齊光滑； CTE722B 的菌落直徑較 CTE722C 的大。 污染病 原 菌的分離 分別挑去菌絲料包上的水珠和污染菇體，進行涂布培養(yǎng)。 在菌絲生長階段，若在無菌條件下去除黃色水珠，會大幅度降 低后期菇體的污染情況以及推遲出現(xiàn)黃色粘稠液體的時間。 3．結(jié)果與分析 污染杏鮑菇樣本的性狀描述 圖 1 菌絲包和菇體樣本污染圖 The sample figure of pollution during mycelial and fruiting bodies growth 從圖 1 可以看出，污染杏鮑菇的樣本在菌絲生長階段，在料袋上出現(xiàn)零星的黃色水珠，黏度不大，這一現(xiàn)象導致菌絲長滿袋的時間延長 57d；且這現(xiàn)象一般出現(xiàn)在袋口附近，緩慢向下蔓延至整個料包的 1/4 為止。 讀取結(jié)果 ， 以所測抑菌圈的平均直徑 (mm)來表示藥劑對細菌的抑菌力。 常用抗生素抗性試驗 采 用 濾紙片 法，以抑菌圈的大小，測定殺菌效果。 取適量待檢菌株置于藥敏培養(yǎng)液中，用無菌加樣滴管取藥敏試驗菌液加入藥敏試驗孔中，每孔加試驗菌液 150μl。 測序 常熟理工學院畢業(yè)設(shè)計（論文） 9 以 Seq Forward、 Seq Internal 和 Seq Reverse 為引物進行 DNA 測序。 反應(yīng)條件： 80℃， 15 min PCR 擴增 使用 TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit（ Code ），進行 PCR擴增目的片段。如試驗菌品好癢細菌．穿刺線上生長物很少，可檢常熟理工學院畢業(yè)設(shè)計（論文） 8 查從培養(yǎng)基表面向下滲入的生長物的情況。如實驗菌在半固體培養(yǎng)基中產(chǎn)氣，氣泡將穿刺線上的生長物擠亂。如 2— 3 天時 仍不能明確判定是否有運動性，可延遲到 5— 6 天再觀察一次。對生長快的細菌應(yīng)培養(yǎng)一天后觀察。如生良物只生長在穿刺線上，邊緣十分清晰，則表示試驗菌無運動性。 用直引穿刺接種試驗菌于半固體培養(yǎng)基內(nèi)，于適溫培養(yǎng)。培養(yǎng)基轉(zhuǎn)為紅色者為陽性，應(yīng)有不含精氨酸空自做對照。 精氨酸雙水解反應(yīng) 培養(yǎng)基：蛋白胨 1g，酚紅 ，牛肉膏 5g， L精氨酸鹽 10g， K2HP04 ，蒸餾水1000ml，瓊脂 6g， ，分裝試管，高度約 45cm。 取 1824h 的斜面或培養(yǎng)液中的菌體點種在上述平板上。 卵磷脂酶測定 培養(yǎng)基：無菌條件下取卵黃加等量的生理鹽水，搖勻后，取 10ml 上述懸液加入到融化的、約 5055℃的 200ml 牛肉膏蛋白胨中，混合均勻后倒人培養(yǎng)皿內(nèi)。如兩種培養(yǎng)基上的生長情況差別不明顯，可在同一培養(yǎng)基上連續(xù)移種三次。凡測定菌在合有碳水化合物培養(yǎng)基中的生長情況明顯超過空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基的生長情況者為陽性。 用菌體懸液，每一個測定菌都須接種未加合碳化合物的空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照。 碳源的利用 常熟理工學院畢業(yè)設(shè)計（論文） 7 培養(yǎng)基 ： (NH4)2SO4 ， NaH2PO4 ? H2O ， K2HPO4 ， MgSO4 ? 7H2O ，CaCl2 ? 2H2O ，蒸餾水 1000ml，含碳化合物 ％， pH 177。結(jié)果觀察：當培養(yǎng)液中滴入 A、 B 液后，溶液如變?yōu)榉奂t色、玫瑰色、橙色、棕色等表示亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性。每株菌做 3 個重復(fù)，另留兩管不接種作對照。培養(yǎng) 1～ 7d，觀察含有硝酸鉀的培養(yǎng)基中有無氣泡，如產(chǎn)生氣泡表示有反硝化作用產(chǎn)生氨氣，是陽性反應(yīng)；如不含硝酸鉀的對照培養(yǎng)基也產(chǎn)生氣泡則只能按可疑或陰性處理，不產(chǎn)生氣泡為陰性。平板呈藍黑，菌落四周圍如不變色或移開菌落后摘加新碘液，菌落下瓊脂仍不變色，表示淀粉水解陽性；如變色則為陰性。取新鮮種菌點種，適溫培養(yǎng)。 若細菌未生長，則或是不在明膠培養(yǎng)基上生長，或是基礎(chǔ)培養(yǎng)基不適宜。如明膠凝塊部分或全部在 20℃以下變?yōu)榭闪鲃拥囊后w，則為明膠水解陽性。于 20℃溫箱中培養(yǎng)， 14 和 30d 在 20℃以下的室溫觀察茵的生長情況和明膠是否液化。產(chǎn)黑褐色色素者為陽性，不產(chǎn)黑褐色素者為陰性。濃縮的吲哚和試劑反應(yīng)，乙醚層出現(xiàn)玫瑰紅色，此反應(yīng)為陽性，反之為陰性。 培養(yǎng) 7d 的培養(yǎng)液，沿管壁緩緩加入 毫升的乙醚至培養(yǎng)液，充分震蕩，使乙醚分散于液體中，將培養(yǎng)液靜置片刻，待乙醚浮至液面后再加吲哚試劑?？蓪⑴囵B(yǎng)液置 4850℃水浴中處理 2h 充分搖動，在 4h 內(nèi)出現(xiàn)紅色者為陽性反應(yīng)。 常熟理工學院畢業(yè)設(shè)計（論文） 5 乙酰甲基甲醇試驗（ ） 培養(yǎng)基：蛋白胨 5g，葡萄糖 5g， K2HPO4 5g，水 1000ml， ，每管分裝 45ml 接種試驗菌于以上培養(yǎng)液中，每次 2 個重復(fù)，置適溫培養(yǎng) 2d． 6d。腸桿菌科的菌要求在 37℃培養(yǎng) 4d 檢查。 接觸酶 將測定菌按種于適宜的斜面上，適溫培養(yǎng) 1824h 取一環(huán)培養(yǎng) 1824h 的菌苗涂于于凈的載破片上，然后滴上一滴 310％的過氧化氫 ，若有氣泡 (氧氣 )，則為接觸酶陽性反應(yīng)，無氣泡為陰性反應(yīng)。 色素的產(chǎn)生 修改金氏 (King)等培養(yǎng)基配方如下： 金氏等 A培養(yǎng)基 金氏等 B培養(yǎng)基 蛋白胨 2g 2g K2SO4 1g ― 甘油 1g 1g MgCl2 ― K2HPO4 ― MgSO4?7H20 ― 瓊脂 2g 2g 蒸餾水 100ml 100ml 調(diào) PH 為 ， 用新鮮菌種按種上述兩種培養(yǎng)基上，于 2830℃培養(yǎng) 14d 觀察。 常熟理工學院畢業(yè)設(shè)計（論文） 4 氧化酶 直接在菌苔上滴加 鹽酸二甲基對苯二胺 (或鹽酸對氨基二甲基苯胺 )1％水溶液 ，不可過濕。 病原菌的生理生化性狀 參照文獻 [5,7,8,9] 葡萄糖氧化發(fā)酵作用的測定 本試驗采用休和利夫森二氏培養(yǎng)基，其配方如下：蛋白胨 2g， NaCl 5g， K2HPO4 ，葡萄糖 10g，蒸餾水 1000ml， 1％溴麝香草酚藍水溶液 3ml， 用接種環(huán)挑取少量菌種于試管中培養(yǎng) 2448h。 病原菌的 形態(tài)觀察及染色 將 病原菌 在 牛肉膏 蛋白胨 培養(yǎng)基上 30℃培養(yǎng) 24 h 后， 觀察 牛肉膏蛋白胨 平板菌落形態(tài)、 牛肉膏蛋白胨 斜面菌苔形態(tài)、肉汁凍液體培養(yǎng)基中的生長情況。 培養(yǎng) 24h 后，挑去出現(xiàn)的單菌落，采用平板劃線分離法，進行 病原菌的分離純化，純化培養(yǎng)菌株 2 個，分別記為： S S2。 課題主要研究內(nèi)容 從杏鮑菇生產(chǎn)廠（昆山正興食用菌有限公司）中污染的 生產(chǎn)包 分離純化，得到純菌落；查閱資料，做相關(guān)的生理生化實驗；提取相關(guān)基因，測序，比對，鑒定實驗菌的種類；查閱相關(guān)資料，考察不同的抗生素對實驗菌的藥性，找出對該實驗菌的防治措施。 發(fā)病癥狀發(fā)病的菇體先在菌蓋表面產(chǎn)生褐色斑塊 , 隨著菇體 的生長 , 褐斑逐漸擴大 , 深入菌蓋 , 直至整個子實體全部變褐至黑褐 , 而萎縮死亡 , 最后腐爛。 病原該病由一種假單孢桿菌引起。 癥狀染病菇畸形、褐色 , 典型特征是菌蓋歪斜 , 菇柄基部稍膨大 , 但不腐爛 , 逐漸萎縮、干枯 , 發(fā)病嚴重時 , 菌柄全部變褐色。 病原據(jù)鑒定 , 細菌性軟腐病是由一種螢光假單胞桿菌引起。 細菌性軟腐病主要危害平菇、金針菇 、杏鮑菇 [4], 極為嚴重。濕度大時 , 凹斑內(nèi)有粘稠的菌液 , 當病斑干后 ,菌蓋往往開裂。 常熟理工學院畢業(yè)設(shè)計（論文） 2 常見細菌病害 [3] 細菌性斑點病 , 又叫細菌性褐斑病 ,主要危害蘑菇和平菇。比利時學者 M． GOOT 等人應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)對分離到的 20 多個菌株進行了比較鑒定后分成 7 個類型。此后 ,有關(guān)細菌性斑點病的研究向深度和廣度展開。后來美國、法國、丹麥、英國、德國、荷蘭、澳大利亞等國相繼報道，并推廣用漂白粉水溶液進行防治。多年來 , 我們研究對造成杏鮑菇病害的細菌對指導食用菌生產(chǎn)具有一定的現(xiàn)實意義 , 對提高杏鮑菇栽培的產(chǎn)量、質(zhì)量和效益發(fā)揮了很大作用。 近年在杏鮑菇工廠化生產(chǎn)過程中出現(xiàn)了嚴重的污染菌，有些菇農(nóng)種植的杏鮑菇其污染率超過了 50％以上，杏鮑菇生產(chǎn)因污染菌造成的損失達億元以上。 變性 ................................................................................................................................ 8 PCR 擴增 ....................................................................................................................... 8 測序 ...............................