【正文】 6. 在實(shí)驗(yàn)室記錄單上記錄輔助孵化操作。3. 在40倍物鏡下，把胚胎的透明帶對準(zhǔn)預(yù)設(shè)的激光焦點(diǎn)。(一) 指征1. 女方年齡≥37歲：隨著女方年齡的增長，卵子的質(zhì)量也較差，胚胎透明帶常會(huì)變硬，失去正常彈性，高齡不孕者的低妊娠率與透明帶變硬有關(guān)。10. 登記病人名字、復(fù)蘇時(shí)間、復(fù)蘇胚胎數(shù)目、管數(shù)、胚胎情況等。6. 在剩下的兩孔中分別加入400ml的WSWS2液。2. 取1個(gè)四孔板，在蓋子上標(biāo)記TS、DS、WSWS2液，先在兩個(gè)孔中加入TS、DS液各400ml。10. 登記病人名字、冷凍時(shí)間、冷凍胚胎數(shù)目、冷凍載體數(shù)、儲(chǔ)存位置、胚胎情況等。7. 胚胎在VS中放置30秒，期間將胚胎移動(dòng)13次。6. 從培養(yǎng)箱內(nèi)拿出培養(yǎng)皿，用拉制的巴氏德管將胚胎轉(zhuǎn)入四孔板。3. 填寫冷凍單。7. 完成實(shí)驗(yàn)室記錄。5. 完成實(shí)驗(yàn)室記錄。2. D3當(dāng)天，提前30分鐘打開恒溫操作臺(tái)，將圓底加熱試管架放置于臺(tái)面同時(shí)加熱，使溫度穩(wěn)定在37℃左右。（5） 填寫移植單的移植情況，移植者和核對者簽名。（2） 從培養(yǎng)箱中取出ET皿，將ET管接上1ml注射器，來回抽吸空氣，潤滑注射器， 長的移植液，再將移植內(nèi)管抬出液面，然后在顯微鏡下將移植內(nèi)管伸入移植皿胚胎旁邊，吸取少量移植液后再吸取胚胎，此段約長2cm（約10ml）,確認(rèn)胚胎裝入移植管中，最后把移植管頭在移植液中輕點(diǎn)封管，即裝管完畢。通常D2選擇25細(xì)胞，D3選擇610細(xì)胞。移植囊胚不超過2個(gè)。六、 胚胎移植實(shí)驗(yàn)室操作常規(guī)1. 移植前一天根據(jù)需要進(jìn)行胚胎移植的患者個(gè)數(shù)準(zhǔn)備移植皿，在Falcon 3037胚胎移植皿外圈加入G1 Plus或G2 Plus 3ml，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜平衡。2. 原核的觀察在受精后的1620小時(shí)進(jìn)行，D2胚胎觀察在受精后的4044小時(shí)進(jìn)行，D3胚胎觀察在受精后的6468小時(shí)進(jìn)行，D5胚胎觀察在受精后112116小時(shí)進(jìn)行。6期：孵出囊胚完全從透明帶孵出。2期：囊胚腔超過了胚胎體積的1/2。II級：細(xì)胞大小略不均勻，形狀略不規(guī)則；胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象；碎片在6－20％之間。2. 異常受精卵多PN、1PN或者卵質(zhì)內(nèi)沒有原核，此類受精卵不適合進(jìn)行移植。注射針刺入卵子后，卵子無明顯變形，破膜感覺不明顯。胞質(zhì)回吸后在透明帶附近破膜。MI期卵子：細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)消失，但第一極體尚未排出。Ⅳ級：這級卵子通常為過熟卵子。Ⅱ級：這級卵子通常為接近成熟的卵子。（5） 精子注射進(jìn)入胞漿的深度約為卵子直徑的5075%。15. 注意事項(xiàng)（1） 將精子和卵子加入操作皿中都必須雙人核對皿上的患者姓名、精子、卵子的標(biāo)記，并簽名確認(rèn)。13. 卵胞漿內(nèi)單精子注射：降下持卵針，并輕撥動(dòng)卵子，使第一極體位于12點(diǎn)或6點(diǎn)位置，固定卵子。將注射針降入ICSI操作皿的PVP液滴中，調(diào)節(jié)顯微鏡使注射針清晰可見，同時(shí)吸入少量PVP進(jìn)入注射針。在4物鏡下調(diào)整持卵針和注射針，依次調(diào)節(jié)其角度與位置，使兩者針頭相對并與載物臺(tái)平行，前后左右移動(dòng)操作針，20物鏡下檢查所操作針的移動(dòng)范圍。中間做三個(gè)圓形的PVP滴，每滴7ml；左方用7ml PVP劃寫一個(gè)橢圓；右方用平衡后的GMOPSTM Plus做數(shù)個(gè)7ml的液滴；如下圖所示。要求端口平齊并鈍化。4. 取卵后24小時(shí)對卵子進(jìn)行脫顆粒細(xì)胞操作。2. 培養(yǎng)液準(zhǔn)備：按每個(gè)剝卵用培養(yǎng)皿處理8個(gè)左右卵子，每個(gè)培養(yǎng)皿需要4mlGMOPS Plus。用另一根微吸管將所有已脫顆粒的受精卵轉(zhuǎn)移到卵裂皿中央液滴洗滌23次后轉(zhuǎn)移至周圍的液滴中。要求端口平齊并鈍化。（二） IVF受精卵脫顆粒細(xì)胞1. 卵子脫顆粒細(xì)胞的前一日，根據(jù)取卵數(shù)目準(zhǔn)備卵裂液培養(yǎng)皿。5. 從培養(yǎng)箱拿出受精皿，雙人核對皿上標(biāo)記的姓名和小圓底試管上所標(biāo)記的名字是否一致，在顯微鏡下觀察卵子的情況和核對卵子的數(shù)目。2. hCG后3940小時(shí)，取卵后46小時(shí)進(jìn)行IVF授精。6. 為保持卵母細(xì)胞的活性，應(yīng)盡可能縮短卵子暴露在培養(yǎng)箱外的時(shí)間，要求整個(gè)操作過程必須無菌、快速，并注意避光，溫度維持于37℃，以盡量減少培養(yǎng)液的pH值和滲透壓變化。在體視鏡下（2050倍）觀察，確診粘液團(tuán)內(nèi)是否有卵母細(xì)胞存在，如有OCCC附于血凝塊上，可直接用巴斯德吸管分離。2. 檢查實(shí)驗(yàn)室記錄單上患者的姓名，并與患者和臨床醫(yī)生當(dāng)面核對，確保無誤。4. 洗卵液的準(zhǔn)備：吸取3mlGIVF Plus培養(yǎng)基放入圓底試管（Falcon 2001）中，每個(gè)患者準(zhǔn)備2管，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱平衡。9. 完成相應(yīng)實(shí)驗(yàn)室記錄和病歷。用平衡好的GIVF Plus至少洗滌一次后，將曲細(xì)精管移在另一有GIVF Plus的Falcon3001皿中，在體視鏡下，用兩個(gè)注射器針頭，劃開曲細(xì)精管，在倒置顯微鏡下觀察是否有精子。4. 用無菌巴斯德吸管在火焰上滅菌，再把吸管尖燒成圓燉，冷卻后待用，并連同15ml、5ml的圓底試管標(biāo)上患者的姓名。9. 完成相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室記錄和病歷。5. 附睪穿刺手術(shù)中，實(shí)驗(yàn)室人員用移液器吸取少量送檢的附睪抽吸液涂于無菌Falcon3001培養(yǎng)皿，在顯微鏡下觀察是否有精子；如發(fā)現(xiàn)有活精子，精子數(shù)目足夠ICSI，通知男科醫(yī)生結(jié)束手術(shù)；如未見足量精子，重復(fù)上述操作。準(zhǔn)備90%密度梯度離心液、45%密度梯度離心液各1ml，使用前配好并在1小時(shí)內(nèi)使用。精液和尿液樣本都需要進(jìn)行分析。3. 在取卵的當(dāng)天早上，患者應(yīng)該在起床排空尿后，在取精的前23小時(shí)，再服用小蘇打片2片（1g/片）喝5001000ml水，如此能夠最大限度降低尿液的滲透壓。當(dāng)藥物治療不能達(dá)到目的時(shí)，有必要從尿液中提取精子。（4） 根據(jù)復(fù)蘇后精子的活動(dòng)力和精子密度，選擇相應(yīng)的處理方法。（7） 將精液冷凍患者的信息，精液分析結(jié)果，及冷凍位置及編號詳細(xì)記錄于精液冷凍登記本。（3） 將精液加入試管中，按照1：1的比例緩慢加入復(fù)溫的冷凍保護(hù)劑，邊加邊混勻，充分混勻精液與冷凍保護(hù)劑。（10） 顯微鏡下觀察并記錄處理后的精子濃度、活力，松開蓋子，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱待用。（6） 把精子混懸液分散在1ml的培養(yǎng)液中。（2） 以1：2（精液：培養(yǎng)液）的體積比例，稀釋精液標(biāo)本。加精液時(shí)應(yīng)慢慢沿著管壁滴入，精液避免與梯度離心液混合，和梯度液之間要有明顯分層。（4） 取上層液體，顯微鏡下觀察并記錄處理后的精子濃度、活力，松開蓋子，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱待用。置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱待用。（4） 去上清，將其加入3ml GIVF Plus中吹打混勻。4. 根據(jù)選擇的方法，準(zhǔn)備試劑和耗材進(jìn)行精液樣本處理。（2） 觀察精液的粘液絲，精子的凝集及非精子細(xì)胞（包括上皮細(xì)胞，圓形細(xì)胞及斷裂的精子頭或尾部）（3） 評估精子的密度（4） 評估精子的活力和活率（WHO第5版SOP）(三) 精液處理操作常規(guī)1. 精液的參數(shù)和來源決定應(yīng)該選擇何種精子制備方法精子特征處理方法射出精液濃度≥5106/ml且PR精子≥15%雙層梯度離心+洗滌后上游法1106/ml≤濃度≤5106/ml濃度≥5106/ml且PR精子≤15%雙層梯度離心法附睪取出精，精子數(shù)≥1106/ml且PR精子≥15%微量梯度離心法射出精液濃度＜1106/ml附睪取出精＜1106/ml睪丸精子標(biāo)本直接離心洗滌法2. 密度梯度法參數(shù)可以根據(jù)不同標(biāo)本的特征來修改是方法發(fā)到最優(yōu)化，如：減少梯度體液體體積即減少精子需要移動(dòng)的距離從而可以提高獲得正常精子的數(shù)量；對于高粘度的標(biāo)本，可以增加離心和和離心時(shí)間。（2） 精液液化延遲的處理，如果60分鐘內(nèi)精液仍未液化，加入等量的含有蛋白的GIVF再機(jī)械吹打以幫助液化，至精液完全液化再進(jìn)行常規(guī)分析和處理。3. 用避孕套采集樣本（1） 對于通過手淫法采集精液困難者，則采用特制的避孕套通過性交法獲取精液。（6） 中心任何工作人員發(fā)現(xiàn)患者身份可疑，必須停止接收，重新核實(shí)患者身份，不能同時(shí)接收2份或以上標(biāo)本，如懷疑標(biāo)本混亂，必須停止接收。（2） 精液需經(jīng)手淫法收集到一次性無菌無毒的干燥容器內(nèi)，強(qiáng)調(diào)樣本收集必須完整，確認(rèn)是否取精困難，并告訴患者如何運(yùn)送精液標(biāo)本。4. 實(shí)踐練習(xí)：練習(xí)拉管、裝針、模擬拾卵、吹打去除顆粒細(xì)胞、少弱精子的分離處理。(四) 一次性耗材按常規(guī)進(jìn)行質(zhì)控，一旦出現(xiàn)異常，立即更換批號。5. CO2鋼瓶：定期檢測氣壓，及時(shí)更換。3. 顯微鏡：準(zhǔn)備燈泡與保險(xiǎn)絲的備件，出現(xiàn)故障時(shí)及時(shí)更換。試劑名稱作用貨號Vitrolife G5系列GMOPSTMGMOPSTMPLUS非CO2依賴型培養(yǎng)液在室溫、大氣環(huán)境中處理、操作卵子和胚胎K021893GIVFTMPLUS洗精、受精液上游、受精K022245G1TMPLUS卵裂胚培養(yǎng)液原核期、DD3胚胎培養(yǎng)K022244G2TMPLUS囊胚培養(yǎng)液囊胚培養(yǎng)K021890HYASETM，透明質(zhì)酸酶消化、移除卵丘細(xì)胞K000627ICSITM，PVP精子制動(dòng)K043116OVOILTM，培養(yǎng)用石蠟油避免液體揮發(fā)和污染K991351SpermRinseTM洗精液精子處理：洗精K000621SpermGradTM梯度離