【正文】 ?如果配體是蛋白質(zhì)等一些易于變性的物質(zhì)，則應(yīng)注意處理時(shí)不能改變配體的活性。 7) 放射性分析法：偶聯(lián)中加入一定量帶有同位素的配體，通過(guò)放射性分析確定配體結(jié)合量，這是一種非常靈敏的方法。 2) 直接光譜測(cè)量：對(duì)于能夠吸收 250nm以上波長(zhǎng)的配體，可以直接用光譜法測(cè)定與基質(zhì)結(jié)合的配體的量。 ?配體與基質(zhì)偶聯(lián)后，通常要測(cè)定配體的結(jié)合量以了解其與基質(zhì)的偶聯(lián)情況，同時(shí)也可以推斷親和層析過(guò)程中對(duì)待分離的生物大分子吸附容量。 ?另外通過(guò)碳二亞胺、戊二醛等雙功能試劑的作用也可以使配體與基質(zhì)偶聯(lián)。 ② 通用性配體一般是指特異性不是很強(qiáng)，能和某一類(lèi)的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體，如各種凝集素（ lectine）可以結(jié)合各種糖蛋白，核酸可以結(jié)合 RNA、結(jié)合 RNA的蛋白質(zhì)等。 配體的分類(lèi) ?根據(jù)配體對(duì)待分離物質(zhì)的親和性的不同，可以將其分為兩類(lèi)：特異性配體（ specific ligand）和通用性配體（ general ligand）。 ② 配體與待分離的物質(zhì)之間的親和力要有較強(qiáng)的特異性 ?也就是說(shuō)配體與待分離物質(zhì)有適當(dāng)?shù)挠H和力，而與樣品中其它組分沒(méi)有明顯的親和力，對(duì)其它組分沒(méi)有非特異性吸附作用。 ?加入手臂的長(zhǎng)度要恰當(dāng)，太短則效果不明顯；太長(zhǎng)則容易造成彎曲，反而降低吸附效率。例如Pharmacia公司生產(chǎn)的 AHSepharose 4B和 CHSepharose 4B就是分別將 1,6乙二胺， 6氨基乙酸與 CNBr活化的瓊脂糖反應(yīng)引入間隔臂分子。 多孔玻璃珠的活化 ?對(duì)于多孔玻璃珠等無(wú)機(jī)凝膠的活化通常采用硅烷化試劑與玻璃反應(yīng)生成烷基胺 玻璃 ?在多孔玻璃上引進(jìn)氨基，再通過(guò)這些氨基進(jìn)一步反應(yīng)引入活性基團(tuán)，與適當(dāng)?shù)呐潴w偶聯(lián)。 ?前兩種方法是比較常用的方法，另外還有很多種活化方法如： ?N－羥基琥珀酰亞胺（ NHS）活化 ?三嗪（ triazine）活化 ?高碘酸鹽（ periodate）活化 ?羰酰二咪唑（ carbonyldiimidazole）活化 ?2,4,6三氟 5－氯吡啶（ FCP）活化 ?乙二酸酰肼（ adipic acid dihydrazide）活化 ?二乙烯砜（ divinylsulfone）活化等。 ② 環(huán)氧乙烷基活化 ?活化后的基質(zhì)都含有環(huán)氧乙烷基。利用溴化氰活化的基質(zhì)通過(guò)進(jìn)一步處理還可以得到很多其它的衍生物。常見(jiàn)方法有： 多糖基質(zhì)的活化 ① 溴化氰活化 ②環(huán)氧乙烷基活化 聚丙烯酰胺的活化 多孔玻璃珠的活化 多糖基質(zhì)的活化 ?多糖基質(zhì)是瓊脂糖是一種常用的基質(zhì)。 ③ 多孔玻璃珠的特點(diǎn)是機(jī)械強(qiáng)度好，化學(xué)穩(wěn)定性好。 ④ 基質(zhì)本身與樣品中的各個(gè)組分均沒(méi)有明顯的非特異性吸附，不影響配體與待分離物的結(jié)合。 ③ 基質(zhì)的結(jié)構(gòu)應(yīng)是均勻的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。包括： 基質(zhì)的性質(zhì)與選擇 基質(zhì)的活化 間隔臂分子 配體的性質(zhì)與分類(lèi) 配體與基質(zhì)的偶聯(lián) 親和吸附劑的再生與保存 基質(zhì)的性質(zhì)與選擇 基質(zhì)的性質(zhì) ① 具有較好的物理化學(xué)穩(wěn)定性。 ?制備的親和吸附劑裝柱平衡后，當(dāng)樣品溶液通過(guò)親和層析柱的時(shí)候，待分離的生物分子就與配體發(fā)生特異性的結(jié)合，從而留在固定相上。 親和層析的基本原理 ?生物分子間存在很多特異性的相互作用，如我們熟悉的抗原－抗體、酶－底物或抑制劑、激素－受體等等，它們之間都能夠?qū)Ｒ欢赡娴慕Y(jié)合，這種結(jié)合力就稱(chēng)為親和力。 離子交換柱層析原理 第七節(jié) 親和層析 親和層析簡(jiǎn)介 親和層析的基本原理 親和吸附劑 親和層析操作中的注意事項(xiàng) 親和層析的應(yīng)用 親和層析 簡(jiǎn)介 ?親和層析（ Affinity Chromatography）是利用生物分子間專(zhuān)一的親和力而進(jìn)行分離的層析技術(shù)。 ?目前已有全部氨基酸的自動(dòng)分析儀。 分離純化小分子物質(zhì) ?離子交換層析也廣泛的應(yīng)用于無(wú)機(jī)離子、有機(jī)酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物質(zhì)的分離純化。 ?聚苯乙烯樹(shù)脂廣泛的應(yīng)用于高純水的制備、硬水軟化以及污水處理等方面。 ?如果洗脫峰相對(duì)集中某個(gè)區(qū)域造成重疊，則應(yīng)適當(dāng)縮小梯度范圍或降低洗脫速度來(lái)提高分辨率； ?如果分辨率較好，但洗脫峰過(guò)寬，則可適當(dāng)提高洗脫速度。 ?梯度洗脫的裝置有線性梯度、凹形梯度、凸形梯度以及分級(jí)梯度等洗脫方式。 . 洗脫緩沖液 ?常用梯度洗脫，通常有改變離子強(qiáng)度和改變 pH兩種方式。 ?其次是要使各個(gè)待分離物質(zhì)與離子交換劑有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，并盡量使待分離樣品和雜質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合有較大的差別。 離子交換層析操作中應(yīng)注意的問(wèn)題 層析柱 ?離子交換層析要根據(jù)分離的樣品量選擇合適的層析柱，離子交換用的層析柱一般粗而短，不宜過(guò)長(zhǎng)。 ?另外還要保證平衡離子不對(duì)樣品組分有明顯影響。 ?離子交換劑的轉(zhuǎn)型：指離子交換劑由一種平衡離子轉(zhuǎn)為另一種平衡離子的過(guò)程。使用的酸堿濃度一般小于 mol / L，浸泡時(shí)間一般 30 min。 ?再用酸堿分別浸泡，每一種試劑處理后要用水洗至中性，再用另一種試劑處理，最后再用水洗至中性，這是為了進(jìn)一步去除雜質(zhì)，并使離子交換劑帶上需要的平衡離子。 ?離子交換劑顆粒大小。再用水洗至中性。尤其對(duì)于蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)，在離子交換層析中要選擇合適的 pH以使樣品組分能充分的與離子交換劑交換、結(jié)合。 ?離子強(qiáng)度增大，交換容量下降。 ?這些因素主要影響離子交換劑中能與樣品組分進(jìn)行作用的有效表面積。 交換容量 ?指離子交換劑能提供交換離子的量，它反映離子交換劑與溶液中離子進(jìn)行交換的能力。分為強(qiáng)堿型、中等堿型和弱堿型三類(lèi)。 ?結(jié)合磺酸基團(tuán)（ SO3H），如磺酸甲基（簡(jiǎn)寫(xiě)為SM）、磺酸乙基（ SE）等為強(qiáng)酸型離子交換劑。 離子交換劑的電荷基團(tuán) ?根據(jù)與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的電荷基團(tuán)的性質(zhì)，可以將離子交換劑分為陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。 111 What happens in ion exchange? Sample application and wash Elution Equilibration Regeneration + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + a n i o ne x c h a n g e rbead 離子交換劑的種類(lèi)和性質(zhì) 離子交換劑的基質(zhì) ?聚苯乙烯離子交換劑機(jī)械強(qiáng)度大、流速快。 ?一般來(lái)講，離子價(jià)數(shù)越高，結(jié)合力越大；價(jià)數(shù)相同時(shí)，原子序數(shù)越高，結(jié)合力越大。 ?平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱(chēng)陰離子交換劑。 ?離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子。 ?上世紀(jì) 40年代，出現(xiàn)了具有穩(wěn)定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹(shù)脂。 ?例如將干燥的 Sephadex（粗顆粒）加入溶液中， Sephadex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物質(zhì)也會(huì)滲透進(jìn)入凝膠孔穴內(nèi)部，而大分子物質(zhì)則被排阻在外。 ?它們是一類(lèi)分子量很大的物質(zhì)，所以可以利用凝膠層析的排阻效應(yīng)將這些大分子熱源物質(zhì)與其它相對(duì)分子量較小的物質(zhì)分開(kāi)。 ?一般來(lái)講，洗脫速度慢一些樣品可以與凝膠基質(zhì)充分平衡，分離效果好。 ?分級(jí)分離時(shí)，加樣體積約為凝膠柱床體積的1％ ~5％左右，而分組分離時(shí)加樣體積約為凝膠柱床體積的 10％ ~25％。 ?為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽。 ? 如果色帶彌散、歪曲，則需重新裝柱。 ?用于分組分離的凝膠柱，如脫鹽柱由于對(duì)分辨率要求較低，所以一般比較短。 凝膠層析操作中應(yīng)注意的問(wèn)題 層析柱的選擇 凝膠柱的鑒定 洗脫液的選擇 加樣量 洗脫速度 層析柱的選擇 ?層析柱大小主要是根據(jù)樣品量的多少以及對(duì)分辨率的要求來(lái)進(jìn)行選擇。 凝膠的保存 ?凝膠的保存一般是反復(fù)洗滌去除蛋白等雜質(zhì)，然后加入適當(dāng)?shù)目咕鷦ǔ＜尤?％的疊氮化鈉， 4℃ 下保存。 ?外多孔玻璃珠和多孔硅膠也不需膨化處理。 干膠的膨化 ?一般吸水率較小的凝膠（即型號(hào)較小、排阻極限較小的凝膠）膨化時(shí)間較短，在 20℃ 條件下需 3~4小時(shí) ?吸水率較大的凝膠（即型號(hào)較大、排阻極限較大的凝膠）膨化時(shí)間則較長(zhǎng)， 20℃ 條件下需十幾個(gè)到幾十個(gè)小時(shí)。選擇時(shí)要依據(jù)分離的具體情況而定， ?例如樣品中各個(gè)組分差別較大，則可以選用大顆粒的凝膠，這樣可以很快的達(dá)到分離的目的；如果有個(gè)別組分差別較小，則要考慮使用小顆粒凝膠以提高分辨率。例如蛋白樣品的脫鹽或蛋白、核酸溶液去除小分子雜質(zhì)以及一些注射劑去除大分子熱源物質(zhì)等等。 ?例如 Pharmacia Biotech的 Superdex和Superrose ? Superdex的分辨率非常高，化學(xué)物理穩(wěn)定性也很好，可以用于 FPLC、 HPLC分析。 ?多孔硅膠和多孔玻璃珠的分離范圍都比較寬 ?多孔硅膠一般為 102~5 106 ?多孔玻璃珠一般為 3 103~9 106。 多孔硅膠、多孔玻璃珠 ?這類(lèi)凝膠是由硅膠或玻璃制成具有一定直徑的網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)的球形顆粒。 聚丙烯酰胺和瓊脂糖交聯(lián)凝膠 ?這類(lèi)凝膠是由交聯(lián)的聚丙烯酰胺和嵌入凝膠內(nèi)部的瓊脂糖組成。 ?瓊脂糖凝膠的排阻極限很大，分離范圍很廣，適合于分離大分子物質(zhì)，但分辨率較低。 ?瓊脂糖凝膠的商品名因生產(chǎn)廠家不同而異，常見(jiàn)的主要有 Pharmacia Biotech生產(chǎn)的 Sepharose（ 2B ~ 4B）和 BioRad Laboratories生產(chǎn)的 Biogel A等。 ?聚丙烯酰胺凝膠不會(huì)象葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠那樣可能生長(zhǎng)微生物。 ?聚丙烯酰胺凝膠在酸中的穩(wěn)定性較好，在 pH為1~10之間比較穩(wěn)定。 ?主要由 BioRad Laboratories生產(chǎn)，商品名為 BioGel P，主要型號(hào)有 BioGel P2 ~ BioGel P300等 10種，后面的數(shù)字基本代表它們的排阻極限的 103，所以數(shù)字越大，可分離的分子量也就越大。 ?Sephacryl穩(wěn)定工作的 pH一般為 3~11。是一種比較新型的葡聚糖凝膠。 ?Sephadex有各種顆粒大?。ㄒ话阌写?、中、細(xì)、超細(xì)）可以選擇，一般粗顆粒流速快，但分辨率較差；細(xì)顆粒流速慢，但分辨率高。但一般在離子強(qiáng)度大于 ，幾乎沒(méi)有吸附作用。 ?Sephadex穩(wěn)定工作的 pH一般為 2~10。 ?Sephadex的親水性很好，在水中極易膨脹，不同型號(hào)的 Sephadex的吸水率不同，它們的孔穴大小和分離范圍也不同。常見(jiàn)的有兩大類(lèi)，商品名分別為 Sephadex和 Sephacryl。 凝膠的種類(lèi)和性質(zhì) ?凝膠的種類(lèi)很多，常用的凝膠主要有： ?葡聚糖凝膠（ dextran） ?聚丙烯酰胺凝膠（ polyacrylamide） ?瓊脂糖凝膠（ agarose） ?以及聚丙烯酰胺和瓊脂糖之間的交聯(lián)物。 凝膠顆粒大小 ?層析用的凝膠一般都成球形，顆粒的大小通常以目數(shù)（ mesh）或者顆粒直徑（ mm）來(lái)表示。 ?對(duì)于同一型號(hào)的凝膠，球形蛋白與線形蛋白的分級(jí)分離范圍是不同的。 ?排阻極限代表一種凝膠能有效分離的最大分子量，大于這種凝膠的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到分離。lg MW＋ c‘ ? 其中 b‘、 c’為常數(shù)。 ?對(duì)于某一型號(hào)的凝膠，在一定的分子量范圍內(nèi)，各個(gè)組分的 Kav與其分子量的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系： Kav＝ － b在凝膠層析中，分配系數(shù)通常表示為： Kav=(VeV0)/(VtV0) ?完全排阻的大分子， Ve＝ Vo，故 Kav＝ 0。 ?外水體積 Vo可以通過(guò)測(cè)定完全排阻的大分子物質(zhì)的洗脫體積來(lái)測(cè)定，一般常用藍(lán)色葡聚糖 2022作為測(cè)定外水體積的物質(zhì)。對(duì)于完全排阻的大分子，由于其不進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而只存在于流動(dòng)相中，故其洗脫體積 Ve＝ Vo；對(duì)于完全滲透的小分子，由于它可以存在于凝膠柱整個(gè)體積內(nèi)（忽略凝膠本身體積 Vg），故其洗脫體積 Ve＝ Vt?；|(zhì)體積是指凝膠顆粒實(shí)際骨架體積。這樣樣品經(jīng)過(guò)凝膠層析后，各個(gè)組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達(dá)到了分離的目的。層析過(guò)程如圖 所示。 ?1964年， Moore制備了具有不同孔徑的交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，能夠進(jìn)行有機(jī)溶劑中的分離，稱(chēng)為凝膠滲透層析（流動(dòng)相為有機(jī)