掌握層析chromatography的概念-wenkub.com
2025-05-08 10:53 本頁面
【正文】 隨著淋洗進行，樣品中各種色素向下移動的速度不同，逐漸形成一圈圈的連續(xù)色帶。將出口打開，使表面的蒸餾水流出，直至恰好與表面相平（不可使床面干掉），關緊出口，用滴管將上述樣品緩緩地加到床表面，注意盡量 不要使平整的床表面攪動 ，然后打開出口，讓樣品進入床內(nèi)，直至床面恰好露出，用上法不斷加蒸餾水洗滌 ， 立即用試管收集，待紅色流盡，換試管收集。 七 .應用 凝膠層析法分離蛋白質(zhì) [原理 ] 血紅蛋白 （ Hb， 分子量 64 480左右 ）與二硝基苯 — 魚精蛋白 （ DNP— 魚精蛋白 ，分子量 2 000— 12 000） 混合物 ， 由于分子大小不同 ， 通過 Sephadex G— 50層析受阻滯程度有差異 ， 從而達到分離 。 六 .其它條件選擇 層析的長度 （ L） 與直徑 （ D） 之比 （ L/D）對層析分辨率有影響 ,一般對用于 組別分離 的層析柱其 L/D為 15～ 18： 1,層析柱的體積一般大于樣品體積的 4～ 10倍 ,這類常用于脫鹽 .對于 分級分離 可采用 L/D 40： 1,甚至 100： 1,層析柱體積一般大于樣品體積的 25倍 。 Sephadex的 化學性質(zhì)穩(wěn)定 ,不溶于水、鹽、弱酸和堿 , 耐熱耐堿不耐酸 。 四 .凝膠的結構與性能 （ 商品名為 Sephadex） 結構： 葡聚糖用交聯(lián)劑 1氯代 2 ,3環(huán)丙烷使葡聚糖之間通過醚鍵 (COCH2CHCH2O)交聯(lián) 聚合而成的 三維空間網(wǎng)狀結構 。 ,重復性好 .如果按比例擴大柱 的體積和高度 ,可進行大量樣品的分離純 化 。 ? 因此分子的正常 Kd值 0~1之間 ,這種由小到大的 Kd值順序決定了物質(zhì)流出的順序 。Wr求得 （ g為干凝膠重 ,單位為克 ,Wr為凝膠的吸水量以 ml/g表示 ） 。 ? 它只與 被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆?？紫兜拇笮》植?有關 ， 而與柱的長短粗細無關 ， 也就是說它對每一物質(zhì)為常數(shù)與柱的物理條件無關 。 ? 洗脫體積 （ Ve） … 即欲分離物質(zhì)通過層析 ? 柱洗脫下來所需洗脫液 ? 的總體積 。 進入具有一定孔徑的凝膠柱后 ,較 大 的分子 不能進入凝膠孔隙 中 ,被排阻在外 ,而較小 的分子則 能進入凝膠孔隙 ,加入洗脫劑后 ,大分子 就隨洗脫劑從凝膠間隙洗脫下來 ,受到的 阻力小 ,其 流速較快 ,小分子 物質(zhì)從上一層凝膠孔隙中出來又擴散到下一層凝膠孔隙中 ,這樣 多次反復 ,大分子物質(zhì)先從柱中流出 ,小分子物質(zhì)后流出 。 凝膠層析 Gel Chromatography 一、定義 凝膠層析 … 是按照 被分離物質(zhì)分子大小 ,經(jīng)過具有一定孔徑的多孔物質(zhì)進行分離的一種方法 。 混合物中各組分若 K值相差較大 , 則能較易 地把混合物中的生物物質(zhì) 分離 。在分配層析中 ,K為分配系數(shù) 。 三 .層析的一般原理 (Partition chromatography) 混合物在層析過程中不管層析技術采用哪兩種狀態(tài)的相 (流動相和固定相 )都能達到 分配平衡 ， 用來敘述 一種物質(zhì)在兩種特定相中的分配程度 是用分配系數(shù)表示
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