【正文】 鹽溶 鹽析 。 若兩個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生這種特異的相互作用的話，那么可以認(rèn)為它們之間的功能可能存在某種相關(guān)性。 （二）細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù) 將編碼某種蛋白質(zhì)的目的基因（真核生物中一般使用的是對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的 cDNA序列）插入到一 DNA載體上，使之能夠在待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生出具有活性的蛋白質(zhì)分子。 120 三、蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的追蹤 蛋白質(zhì)分子在折疊、去折疊過(guò)程中，在與其他分子發(fā)生相互作用的時(shí)候都會(huì)發(fā)生構(gòu)象的調(diào)整。 另一個(gè)方法為磁共振（ NMR) X射線晶體衍射法 基本原理： 首先 ，純化的蛋白質(zhì)分子在合適的環(huán)境中進(jìn)行高度有序的排列 而形成所謂的單晶（ single crystals)； 然后， 用一束 X射線（波長(zhǎng)為 ）照射蛋白 晶體中按同樣方式排列的巨大數(shù)目的蛋白分子。 在實(shí)際操作的時(shí)： 從質(zhì)譜上得到的是一系列的多肽片段， 每對(duì)大小相近的片段之間僅僅相差一個(gè)氨基酸殘基。此外，蛋白質(zhì)中含有半胱氨酸殘基時(shí)，有時(shí)兩個(gè)半胱氨酸殘基會(huì)發(fā)生二硫鍵交聯(lián)。每反應(yīng)一次，結(jié)果是得到一個(gè)去掉 N端氨基酸殘基的多肽，剩下的肽鏈可以進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)，繼續(xù)發(fā)生降解。 ?質(zhì)譜技術(shù)－－基于串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的ＡＡ測(cè)序方法 是根據(jù)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定多肽分子質(zhì)量的極高準(zhǔn)確性 這一特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的 ?通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸所對(duì)應(yīng)的 DNA編碼序列上 讀出（從 cDNA序列直接讀出，或從對(duì)應(yīng)的基因組DNA序列中的外顯子序列） 115 Edman降解法： 原理： 用異硫氰酸苯酯（ PITC）與待分析多肽的 N端氨基在堿性條件下反應(yīng)，生成苯氨基硫代甲酰胺（ PTC）的衍生物，然后用酸處理，關(guān)環(huán)，肽鏈 N端被選擇性地切斷，得到N端氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。 一級(jí)結(jié)構(gòu) 空間結(jié)構(gòu) 113 一、氨基酸序列測(cè)定－一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)，測(cè)定一個(gè)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是我們認(rèn)識(shí)一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的前提之一。 這樣我們可以知道與特異抗體對(duì)應(yīng)的抗原蛋白在檢測(cè)的蛋白混合物中是否存在？相對(duì)量是多少？如果蛋白混合物是通過(guò) SDSPAGE分開的話，被檢測(cè)蛋白的分子量也一目了然。 這種高度特異、高度靈敏的 抗體一抗原 結(jié)合反應(yīng)現(xiàn)在被廣泛地應(yīng)用于 檢測(cè)微量蛋白 的存在情況。 103 用質(zhì)譜測(cè)定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，精確一般可達(dá)%，是目前進(jìn)行蛋白質(zhì)分子量測(cè)定最準(zhǔn)確的方法（其準(zhǔn)確度超過(guò) SDSPAGE、彈性光散射和孔徑梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳，甚至分析超速離心等）。 2. 如果蛋白分子能夠在這種低電流電場(chǎng)中長(zhǎng) 時(shí)間保持穩(wěn)定的話，這種方法比 較經(jīng)濟(jì)。 100 孔徑梯度電泳 這是通過(guò)制備具有一定范圍的 從大到小孔徑 梯度的聚丙烯酸胺凝膠 ，然后讓蛋白在非變性條件下在這種凝膠上電泳而進(jìn)行的。 96 沉降平衡超速離心 （ sedimentation equlibrium ultracentrifugation) 用該技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的時(shí)候，測(cè)定的是幾個(gè)絕對(duì)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 2. 反之 ,相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔 ,可自由地進(jìn)出凝膠顆粒的網(wǎng)孔 ,在向下移動(dòng)過(guò)程中 ,它們從凝膠內(nèi)擴(kuò)散到膠粒孔隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒 ,如此不斷地進(jìn)入與逸出 ,使流量增長(zhǎng) ,移動(dòng)速率慢而最后流出層析柱 . 95 3. 而中等大小的分子 ,它們也能在凝膠顆粒內(nèi)外分布 ,部分進(jìn)入顆粒 ,從而在大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)之間被洗脫 .這樣 ,經(jīng)過(guò)層析柱 ,使混合物中的各物質(zhì)按其分子大小不同而被分離 。根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置及形狀，以分析標(biāo)本中所含組分的性質(zhì)。 是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)。 凝膠可用：聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等 86 Pr分子有一定的 PI，它處在一個(gè)由 陽(yáng)極到陰極梯度逐漸增加的介質(zhì)中，并通過(guò)以直流電時(shí)，它便 “ 聚焦 ” 在與 其 PI相同的 pH位置上。 84 聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜 等電聚焦電泳 ——（ isoelectric focusing, IEF） 是一種根據(jù)樣品的等電點(diǎn)不同而使它們?cè)?pH梯度 中相互分離的一種電泳技術(shù)。 81 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS– (十二烷基硫酸鈉 )是陰離子型去污劑 (Sodium dodecyl sulfate, SDS) Q u = （遷移率） 6πrη u 與 Q、 r有關(guān) 若蛋白質(zhì)分子帶有足夠的電荷，在 SDSPAGE中進(jìn) 行電泳，由于分子篩效應(yīng)， u 僅取決于分子的大小。 78 不同波長(zhǎng)范圍的電磁波與其作用后的剩余能量值反映的是蛋白質(zhì)分子的不同特征 : 190 200nm波長(zhǎng)范圍的光吸收反映的是 蛋白質(zhì)主鏈上的酞胺鍵中電子的被激發(fā)； 230 300nm波長(zhǎng)范圍的光吸收譜（最大吸收值在280nm波長(zhǎng)處）反映的是 蛋白質(zhì)分子中芳香族氨基酸側(cè)鏈上電子的被激發(fā)。 74 ⑶離子交換層析：原理與普通離子交換相同。 73 ⑵ 液 液分配層析：固定相為單體固定液構(gòu)成。 67 高效液相層析法（ High Performance Liquid Chromatography ， HPLC） 又稱“ 高壓液相色譜 ，是 色譜法 的一個(gè)重要分支，以 液體 為流動(dòng)相 ，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同 極性 的單一 溶劑 或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的 色譜柱 ，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。 這些被作用的對(duì)象物質(zhì)稱之為 配基 （ ligand) 。 NaCl， KCI甚至濃度高達(dá) 3M時(shí)，也不影響 Pr負(fù)電荷的吸附，相反這些鹽可以大大降低 Pr正電荷 的吸附。 優(yōu)點(diǎn)： 1. 物理吸附，吸附能量比較低，洗脫也比較容易。較小的 分子進(jìn)入能容納它的孔穴，繞道而行，在柱 內(nèi)保留時(shí)間就比較長(zhǎng)。交換容量為離子交換纖維素的 3～ 5倍。 51 52 固定相 ： DEAE纖維素、 CM纖維素 53 ?纖維素 : 骨架為柔性長(zhǎng)鏈 1. 加入量 ： 加入層析柱的蛋白質(zhì)量通常纖維素量的 十分之一。 48 層析分離能力的實(shí)質(zhì) —物質(zhì)的分配問題 *分配系數(shù)： 當(dāng)一種溶質(zhì)分布在兩個(gè)互不相溶的溶劑中時(shí)，它在固定相和移動(dòng)相兩相內(nèi)的 濃度之比 是一個(gè)常數(shù)，這稱為分配系數(shù) 。 ? 缺點(diǎn)： 易使酶和具有活性的蛋白質(zhì)變性。 45 ? 常溫下有機(jī)溶劑可使蛋白質(zhì)變性， 低溫條件 下可減慢變性速度。但含鹽過(guò)多，卻會(huì)使 Pr 過(guò)度析出，不利于分級(jí)沉淀。 此時(shí)溶液的 介電常數(shù) 也相應(yīng)提高，可以減少 Pr的變性。此時(shí)若添加 有機(jī)溶劑，由于 有機(jī)溶劑 可使溶液 電離 常數(shù) 減小，增強(qiáng)了 中性離子間靜電引力，從而使分集合而沉淀出來(lái)。 [Pr]較低 ，需要無(wú)機(jī)鹽的濃度也高，即鹽析 界限變窄。的數(shù)值極小 ? S。代表鹽析的效率， 是與 Pr及鹽種類有關(guān)的特性常數(shù)。 (2)鹽離子 也與 水 這種偶極分子作用，使水分子的活 度降低，導(dǎo)致 Pr水合程度的減少，從而趨使 Pr溶 解度 。 若去除蛋白質(zhì)膠體表面電荷和水化膜兩個(gè)穩(wěn)定因素 ，蛋白質(zhì)極易從溶液中析出 鹽析法 32 33 鹽析法 概念 ：將 中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，破壞水化膜和電荷而使蛋白質(zhì)沉淀，叫鹽析。 一般選擇非離子去污劑 來(lái) 保持膜蛋白生物活性 26 27 四、蛋白分子的穩(wěn)定 防止蛋白質(zhì)分子可能被同時(shí)釋放的蛋白質(zhì)水解酶降解、 Pr空間結(jié)構(gòu)可能被溫度或化學(xué)試劑等環(huán)境因素破壞而喪失生物學(xué)活性等。 24 非離子去污劑 ： 相對(duì)溫和，一般 不會(huì)使蛋白質(zhì)變性 。 作用的結(jié)果是 ：