【正文】 國(guó)內(nèi)外菌種保藏機(jī)構(gòu) ?菌種是一個(gè)國(guó)家的重要資源，世界各國(guó)對(duì)菌種的保藏都極為重視。 ? 另一類方法 ， 可達(dá)到 “ 細(xì)胞純 ” 的水平 ， 采用單胞分離法 ， 也可以二者結(jié)合 ， 先用前一種方法獲得較純的菌種后再采用單胞分離法進(jìn)一步純化 。 ? （ 3)凍結(jié) 將熔封后的安瓿管放慢速凍結(jié)器上 ， 以每分鐘下降 1℃ 的速度冷凍 ， 當(dāng)安瓿管溫度下降至 35℃ 時(shí) ， 即可把安瓿管移入液氮內(nèi)作長(zhǎng)期保藏 。 ? 保護(hù)劑 與冷凍干燥保存一樣 ， 液氮保存菌種也需要有保護(hù)物質(zhì) ， 可以用 10%的甘油 ， 使用方便 、 效果好 ，但有些菌對(duì)甘油敏感 ， 效果不佳 ， 可選用其他保護(hù)劑 ， 常用的有 5%～ 10%(V/V)二甲基亞砜； 20%二甲亞砜加 1%蛋白胨；吐溫 80及 等 ， 糖類也可作為一種保護(hù)劑 ， 但濃度適當(dāng)加以控制 。 七、液氮超低溫保存 ? 本方法是近年推廣使用的一種菌種保存法。 ?（ 6） 含水量的影響 水分含量過(guò)高對(duì)菌存活不利，完全脫水也不利于保存，一般把干燥后的細(xì)胞含水量控制在 3%以下 (1%～ 3%)。 如個(gè)別菌種在脫脂乳作保護(hù)劑的情況下死亡率高達(dá) %， 而采用葡聚糖等混和保護(hù)劑時(shí)死亡率大大減少 。 需用凍干菌種時(shí) ， 取出安瓿管用酒精表面消毒 ， 用小砂輪在無(wú)菌條件下打開 ， 或?qū)碴稠敳吭诰凭珶艋鹧嫔献茻?， 迅速滴上冷的無(wú)菌水 ， 使管破裂 ， 然后用鑷子等輕輕敲碎管口 ， 加入 ～ 菌塊成為懸液 ， 用無(wú)菌滴管或接種環(huán)移至斜面或液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng) 。 干燥時(shí)間以樣品最終水分含量達(dá)到 1%～ 3%為準(zhǔn)。 液體培養(yǎng)的菌種，則需經(jīng)離心收集和用滅菌生理鹽水洗滌細(xì)胞，收集的菌體用保護(hù)劑懸浮制成菌懸液。 (2)保護(hù)劑的選擇及制備 一些對(duì)熱敏感的保護(hù)劑如血清等用過(guò)濾除菌 ， 牛奶 、 葡萄糖及乳糖等要控制滅菌溫度 。 ? 冷凍干燥的基本原理 即是使樣品中的水分在冰凍狀態(tài)下 ， 抽真空減壓 ，使凍結(jié)的 冰直接升華為水蒸氣 ， 使樣品達(dá)到干燥 。 ?冷凍干燥保存的菌種存活時(shí)間長(zhǎng) 、 效果好 ， 一般菌種 可保存 5年以上 ， 有的可保藏 15年以上 不發(fā)生變異 。 ? 方法是 ， 將 80%的甘油高壓蒸汽滅菌待用 。 將培養(yǎng)好的菌種用滅菌脫脂乳或奶粉復(fù)原乳制成孢子懸液 ， 用滅菌鑷子將準(zhǔn)備好的濾紙條在滅菌操作下浸入菌懸液中 ， 充分吸附菌細(xì)胞 ， 取出后放入滅菌小試管或安瓿管中 ， 在真空干燥機(jī)上抽干 ， 真空條件下火焰熔封 ， 冷藏 。 用沙土管保藏的某些抗生素產(chǎn)生菌 保藏期可達(dá) 18年 (土霉素和鏈霉素產(chǎn)生菌 )到 22年 (新霉素產(chǎn)生菌 ) 。 這時(shí)管內(nèi)砂土松散 ， 表明已干燥 。 經(jīng)肉湯檢查確實(shí)證明無(wú)菌即可使用 。 ? 此法用于 細(xì)菌芽孢或產(chǎn)分生孢子的菌種 ， 是現(xiàn)在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中較常用的菌種保藏方法 。 ? 保藏溫度要求在 4～ 4℃ 下 。 也可以用穿刺培養(yǎng) 。 ?低溫保藏法 ?低溫定期移植法 ?石蠟油低溫保藏法 ?干燥保藏 ?甘油管保藏法 ?真空冷凍干燥法 ?液氮超低溫保存 現(xiàn)行的菌種保藏方法有下列諸種 : 一、低溫保藏法 ?這是一種常用的簡(jiǎn)便方法 。 ?如將菌種 處于低溫 、 干燥 、 無(wú)氧和缺乏營(yíng)養(yǎng) 的條件下 ， 就可以使菌種暫時(shí)處于休眠狀態(tài) 。 第四節(jié)、菌種保藏 ?工業(yè)微生物菌種保藏與其他目的的菌種保藏要求有所不同 。 但習(xí)慣上常把以噬菌體 DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過(guò)程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染 。 ? 此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細(xì)菌 ， 它的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便 、 轉(zhuǎn)化效率高 、 適用于任何菌株 。 重組 DNA導(dǎo)入宿主菌 ? 體外連接的重組 DNA分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中才能大量的復(fù)制 、 增殖和表達(dá) 。 不同類型的質(zhì)粒其拷貝數(shù)各異 ， 有嚴(yán)緊型和松弛型兩種 。 ? 已報(bào)道的絲狀真菌 種間 的原生質(zhì)體融合主要是曲霉屬和青霉屬； 屬間 原生質(zhì)體融合主要在酵母中實(shí)現(xiàn)：熱帶假絲酸母 飾針復(fù)膜孢酵母，釀酒酵母 彭貝裂殖酵母等。 ? 原生質(zhì)體的融合與再生 ：兩原生質(zhì)體在促融因子的存在下，發(fā)生融合，重建細(xì)胞壁，形成新的細(xì)胞。 第四是分離子的檢出。 第二是異核體的形成 。 ? 霉菌的雜交育種的步驟為： 第一 選擇直接親本。 放線菌的雜交育種 ?放線菌的基因重組于 1955年至 1957年首先在天藍(lán)鏈霉菌 中發(fā)現(xiàn)，以后在其它科、屬、種中相繼發(fā)現(xiàn)。 ? 首先在大腸桿菌 K12菌株中誘發(fā)一個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型 (A)、不能發(fā)酵乳糖 (Lac)和抗鏈霉素 (SMr)以及對(duì)噬菌體 T l敏感的突變體，可以寫成 AB+LacSMrTs1； ? 另一菌株誘發(fā)成一個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型 (B)，能發(fā)酵乳糖(Lac+)，對(duì)鏈霉菌敏感 (SMs)和抗噬菌體 T l的突變體A+BLac+SM sTr1。 ?由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時(shí)和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進(jìn)行。 誘 變 劑 的 選 擇 菌懸液的制備 單細(xì)胞懸浮液： 106個(gè) /mL 孢子懸浮液： 108個(gè) /mL 誘變：預(yù)實(shí)驗(yàn)確定適宜的誘變條件 篩選：選擇合適的篩選方法 紫外線的誘變育種 ? 紫外線誘變一般采用 15W紫外線殺菌燈 ， 波長(zhǎng)為 2537A． 燈與處理物的距離為 15～ 30cm，照射時(shí)間依菌種而異 ， 一般為幾秒至幾十分鐘 。 ? 條件致死突變型 ： 在某些條件下能成活，在另一些條件下是致死的突變型。 誘變?cè)恚?誘變育種一般采用物理、化學(xué)誘變劑使微生物 DNA的堿基 排列發(fā)生變化，以使排列錯(cuò)誤的 DNA模板形成異常的遺轉(zhuǎn)信息，造成某些蛋白結(jié)構(gòu)變異，而使細(xì)胞功能發(fā)生改變。 將三角玻璃棒浸于酒精中 將三角玻璃棒在火焰上燃燒 （須注意勿使燃燒中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃燒） 使用玻璃棒將菌液均勻涂布開來(lái)，將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中隔天觀察菌落數(shù)目，再依照稀釋倍數(shù)推算出菌液濃度。 將菌液置入，此時(shí)試管須做記號(hào)為第一次稀釋。 步驟八 重復(fù)第六以及第七步驟，由第八步驟的第三區(qū)中劃出第四區(qū)，劃滿剩下的空間。此為第一菌區(qū) 。 增殖培養(yǎng) 方法： 控制培養(yǎng)基成分 控制培養(yǎng)條件 抑制不需要的菌類 純種分離 ?劃線法：簡(jiǎn)單、快捷。 一般園田土和耕作過(guò)的沼澤土中 ， 以 細(xì)菌和放線菌 為主 ， 富含碳水化合物的土壤和沼澤地中 ， 酵母和霉菌 較多 ， 如一些野果生長(zhǎng)區(qū)和果園內(nèi) 。 若將體外篩選出的活性化合物，再用動(dòng)物作試驗(yàn)，可篩選出新的藥理活性化合物生產(chǎn)菌。 ? 隨機(jī)分離方法 ： 制備一系列含有各種類型營(yíng)養(yǎng)成分（生長(zhǎng)限制因素）培養(yǎng)基； 避免使用容易同化的碳源或氮源，（引起分解代謝物阻遏）； 加入緩沖液以減少 pH的變化； 確定含有所需的輔助因子Co2+,Mn2+,Mg2+,Fe2+等。 ２、固體培養(yǎng)基培養(yǎng) ： 常用于分離某些酶產(chǎn)生菌，其選擇培養(yǎng)基中常含有所需酶的基質(zhì)，以便促進(jìn)酶產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)。 要領(lǐng)： 給混合菌群提供一些有利于所需菌株生長(zhǎng)或不利于其他菌群生長(zhǎng)的條件。 這兩種方法都有缺點(diǎn)。 ? 嗜冷菌： 410 ℃ 。 菌種的培養(yǎng) ? 放線菌： 2530℃ 。 ?因大多數(shù) 放線菌 都是嗜中性的，分離培養(yǎng)基的 pH常在 。有人曾廣泛使用石臘棒技術(shù)來(lái)分離諾卡氏菌，從土壤中分離耐酸放線菌。 ? 收集在腐爛的稻草和其它植物材料中的 嗜熱放線菌孢子可在空氣攪動(dòng)下進(jìn)行，并可用簡(jiǎn)單的沉淀室收集孢子。 材料的預(yù)處理 ? 通常采用 熱處理方法 減少材料中的細(xì)菌數(shù)，但許多放線菌的繁殖體，孢子 (如鏈霉菌 )和菌絲片段 (