【正文】 輸液泵應(yīng)具備如下性能： ① 流量穩(wěn)定，其 RSD 應(yīng)＜ %，這對(duì)定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要； ② 流量范圍寬，分析型應(yīng)在 ~10 ml/min 范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到 100 ml/min； ③輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150~300 kg/cm2； ④ 液缸容積?。?⑤ 密封性能好，耐腐蝕。 目前常見(jiàn)的 HPLC 儀生產(chǎn)廠家國(guó)外有 Waters 公司、Agilent 公司（原 HP 公司）、島津公司等，國(guó)內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。而在經(jīng)典 LC 中則影響相對(duì)較小。為了減少柱外效應(yīng)，首先應(yīng)盡可能減少柱外死體積，如使用“零死體積接頭”連接各部件，管道對(duì)接宜呈流線形，檢測(cè)器的內(nèi)腔體積應(yīng)盡可能小。一般在液相色譜中， uopt 很?。ù蠹s~），在這樣的線速度下分析樣品需要很長(zhǎng)時(shí)間，一般來(lái)說(shuō)都選在 1mm/s 的條件下操作。 。因此只有在厚涂層固定液、深孔離子交換樹(shù)脂或解吸速度慢的吸附色譜中， Hs 才有明顯影響。因此應(yīng)采用低粒度固定相和低粘度流動(dòng)相。 Hsm 對(duì)峰展寬的影響在整個(gè)傳質(zhì)過(guò)程中起著主要作用。這是由于在一個(gè)流路中流路中心和邊緣的流速不等所致。由于溶質(zhì)分子在流動(dòng)相、靜態(tài)流動(dòng)相和固定相中的傳質(zhì)過(guò)程而導(dǎo)致的峰展寬。 Dm 為分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)，由于液相的 Dm 很小，通常僅為氣相的 104~105，因此在 HPLC 中，只要流速不太低的話，這一項(xiàng)可以忽略不計(jì)。由于進(jìn)樣后溶質(zhì)分子在柱內(nèi)存在濃度梯度，導(dǎo)致軸向擴(kuò)散而引起的峰展寬?？偟恼f(shuō)來(lái)，應(yīng)采用細(xì)而均勻的載體，這樣有助于提高柱效。渦流擴(kuò)散項(xiàng) A＝ 2λdp， dp 為填料直徑， λ 為填充不規(guī)則因子，填充越不均勻 λ 越大。它把色譜過(guò)程看作一個(gè)動(dòng)態(tài)非平衡過(guò)程，研究過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)因素對(duì)峰展寬（即柱效）的影響。 k2趨于 0 時(shí)， R 也趨于 0； k2 增大， R 也增大。當(dāng) α＝ 1 時(shí)， R＝ 0，無(wú)論柱效有多高，組分也不可能分離。 從基本分離方程可看出，提高分離度有三種途徑：① 增加塔板數(shù)。塔板理論的基本假設(shè)為： 1） 色譜柱內(nèi)存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內(nèi)完全服從分配定律，并很快達(dá)到分配平衡。 式中 α是分離因子，其定義為兩種溶質(zhì)相對(duì)保留值之比，從本質(zhì)上講，α代表了溶質(zhì)之間平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異。 我們 知道，有兩個(gè)因素決定色譜峰相互重疊的程度：峰尖的間距和峰寬。容量因子 k＇大的溶質(zhì)，其分子大部分留在固定相中，因而通過(guò)色譜柱的速度低，保留值較大。正是組分之間平衡分配性質(zhì)的不同使得色譜分離成為可能。 二、液相色譜熱力學(xué)基礎(chǔ) 混和物中不同組分在兩相間平衡分配的差異是色譜法作為一種分離技術(shù)的依據(jù)。 流動(dòng)相保留時(shí)間（ tM）：非保留溶質(zhì)的保留時(shí)間。 分配系數(shù)（ K）：分配色譜中是指溶質(zhì)在固定相中的濃度與溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度之比；吸附色譜中是指吸附劑單位表面積或重量所吸附的量與溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度之比。小分子量的化合物第二部分 色譜分析 17 可以進(jìn)入孔中，滯留時(shí)間長(zhǎng)；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動(dòng)相流出。 分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。它是根據(jù) 被測(cè)組分離子與離子對(duì)試劑離子形成中性的離子對(duì)化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。 pH 值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作用。 3． 離子交換色譜法 固定相是離子交換樹(shù)脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽(yáng)離子交換樹(shù)脂）或季氨基（陰離子交換樹(shù)脂）。為控制樣品在分析過(guò)程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的 pH 值。 一般用非極性固定相（如 C1 C8）；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如 C1 C氨基柱、氰基柱和苯基柱。 2． 液液色譜法 使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。分離過(guò)程是一個(gè) 吸附－解吸附 的平衡過(guò)程。（此外還 有電泳。我們已經(jīng)知道，液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)，那么如何來(lái)選擇 HPLC方法呢？為 了加深對(duì) HPLC的認(rèn)識(shí)，我們先來(lái)看看 HPLC 包含了那些種類。 靈敏度高 —— 紫外檢測(cè)器可達(dá) ，熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá) 。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá) 100 種以上。 二、液相色譜法的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn) HPLC 有以下特點(diǎn)： 高壓 —— 壓力可達(dá) 150~300 Kg/cm2。高效液相色譜法 (High performance Liquid Chromatography，以下簡(jiǎn)稱 HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于 60 年第二部分 色譜分析 15 代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。又稱為色層法、層析法。外標(biāo)法定量。取上清夜進(jìn)行 GC 分析。 稱取具有代表性的 2g 粉末試樣，加石油醚 20mL，振蕩 30min，過(guò)濾，濃縮，定容至 5mL 加濃硫酸 凈化，振搖 ，于 3000r/min 離心 15min。 提取 稱取具有代表性的 各類食品試樣勻漿 20g，加水5mL（視其水分含量加水，使其總水量約 20mL），加丙酮 40mL，振蕩 30min，加氯化鈉 6g，搖勻。 丙酮 正乙烷 石油醚沸程 30oC60oC。 七 應(yīng)用實(shí)例 食品中六六六、滴滴涕殘留量的測(cè)定 1 原理 試樣中六六六、滴滴涕經(jīng)提取，凈化后用氣相色譜法測(cè)定，與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。老化的目的是把固定相的殘存溶劑，低沸點(diǎn)雜質(zhì)，低分子量固定液等趕走，使記錄器基線平直，并在老化溫度下使固定液在擔(dān)體表面有一個(gè)再分布過(guò)程，從而涂得更加均勻牢固。 （廿十）色譜柱的常用填充方法 固定相填充的好壞，將直接影響柱效率 .通常多用泵抽填充法，即把色譜柱的一端塞上玻璃棉，接真空泵，另一端接一漏斗，在抽吸下加入固定相，邊裝邊敲打色譜柱，至固定相不再進(jìn)入為止。對(duì)硅藻土擔(dān)體固定液含量可大些１５－３０％；由于氟擔(dān)體 表面積較小，所以最多只能１０％；至于玻璃微球由于表面積特小，固定液含量便只能保持在０、２５％左右。 （十七）常用的固定液涂量 由于固定液含量對(duì)分離效率的影響很大。 “ 相似相容性原則 ” 是選擇固定液的一般原則，有時(shí)利 用現(xiàn)有的固定液不能達(dá)到滿意的分離結(jié)果時(shí)，往往采用 “ 混合固定液 ” ，應(yīng)用兩種或兩種以上性質(zhì)各不相同的，按適合比例混合的固定液，使分離有比較滿意的選擇性，又不致使分析時(shí)間延長(zhǎng)。 下面就不同情況進(jìn)行討論： a、分離極性化合物，采用極性固定液。物質(zhì)在高粘度的固定液中傳質(zhì)速度慢，柱效率因而降低。在氣相色譜中，通常是將固定液涂敷在載體表面上。 （十三）固體固定相分類 指直接裝填到色譜柱中作為固定相的具有活性的第二部分 色譜分析 12 多孔性固體物質(zhì)。 分離堿性物質(zhì)，如乙醇胺，要用堿洗處理的擔(dān)體。 白色擔(dān)體（如１０１）可用于極性物質(zhì)或堿性物質(zhì)。 ５、其他純化方法：凡是用化學(xué)反應(yīng)來(lái)除去活性作用點(diǎn)或用物理復(fù)蓋以達(dá)到純化擔(dān)體表面性質(zhì)的方法都可以使用。經(jīng)過(guò)這樣處理，擔(dān)體表面形成一層玻璃化的釉質(zhì)，故稱“釉化擔(dān)體”。堿洗的目的是除去表面的三氧化二鋁等酸性作用點(diǎn)，但往往在表面上殘留微量的游離堿，它能分解或吸附一些非堿性物質(zhì)，使用時(shí)要注意。 （十）擔(dān)體進(jìn)行處理的一般方法 常用的擔(dān)體表面并非惰性，它具有不同程度的催化作用和吸附性（特別是固 定液含量低時(shí)和分離極性物質(zhì)時(shí)）造成峰拖尾和柱效下降，保留值改變等 影響，因而需要預(yù)處理。 （４）炭分子篩：中性，表面積大，強(qiáng)度高，祛壽命長(zhǎng)，在微量分析上有無(wú)比的優(yōu) 越性。 非硅藻土類型： （１）氟擔(dān)體：表面惰性好，可用來(lái)分析高極性和腐蝕性物質(zhì)，但裝柱不易，柱效率低些。對(duì)擔(dān)體有如下幾點(diǎn)要求： １、表面積較大，一般應(yīng)在０ .５－２ 米 2 ／克之間； ２、具有化學(xué)惰性和熱穩(wěn)定性； ３、有一定的機(jī)械強(qiáng)度，使涂漬和填充過(guò)程不引起粉碎； ４、有適當(dāng)?shù)目紫督Y(jié)構(gòu)，利于兩相間快速傳質(zhì)； ５、能制成均勻的球狀顆粒，利于氣相滲透和填充均勻性好； ６、有很好的浸潤(rùn)性，便于固定液的均勻分布。 ３、管內(nèi)壁應(yīng)光滑，橫截面應(yīng)均勻呈圓形。一般講柱長(zhǎng)增加四倍，樣品的許可量增加一倍。 ５、進(jìn)樣：一般講進(jìn)樣快，進(jìn)樣量小，進(jìn)樣溫度高其分離效果好。 （１）固體吸附劑或擔(dān)體粗細(xì)：一般采用４０－６０目、６０－８０目、８０－１００目。 ３、載氣流速：載氣流速是決定色譜分離的重要原因之一。 ２、柱溫：是一個(gè)重要的操作變數(shù)，直接影響分離效能和分析速度。 也有用固體進(jìn)樣器進(jìn)樣的。氣體自動(dòng)進(jìn)樣是用定量閥進(jìn)樣，重復(fù)性好，且可自 動(dòng)操作。一般 均采用化學(xué)處理的方法除氧，如用活性銅除氧；采用分子篩、活性碳等吸附劑除 有機(jī)雜質(zhì)；采用矽膠，分子篩等吸附劑除水分。 五 氣相色譜條件的選擇 （一）一般選擇載氣的依據(jù)及氣相色譜常用的載氣 作為氣相色譜載氣的氣體，要求要化學(xué)穩(wěn)定性好；純度高；價(jià)格便宜并易取 得；能適合于所用的檢測(cè)器。色譜過(guò)程是通過(guò)氣相色譜儀來(lái)完成的。 t’R=tRtM d 相對(duì)保留時(shí)間（ r12） 指某組分 1 的調(diào)整保留時(shí)間與另一組分 2 的調(diào)整保留時(shí)間之比。通常用時(shí)間來(lái)表示。穩(wěn)定的基線是一條直線。經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，試樣中的各個(gè)組分就彼此分離而先后流出色譜柱。洗脫的組分隨著載氣繼續(xù)前進(jìn)時(shí)，又可被前面的吸附顆粒所吸附。 其固定相是一種具有較大面積的多孔性的顆粒吸附劑。 二 氣相色譜法的基本原理和氣相色譜術(shù)語(yǔ) 1 色譜過(guò)程 氣相色譜對(duì)多組分的分離依賴于核 心裝置 —— 色譜柱。 第二章氣相色譜法 一 氣相色譜法概述 色譜或?qū)游鍪且环N分離技術(shù)，色譜法是利用色譜技術(shù)進(jìn)行分離分析的方法。 （ 6）玉米、大米、小麥、面粉、花生等試樣按方法提取后，用上述單向展開(kāi)法測(cè)定，薯干用雙向展開(kāi)法測(cè)定。 （ 2）據(jù)以上實(shí)驗(yàn)條件黃曲霉毒素 B1 的最低檢出量是 微克，方法的靈敏度為 5 微克 /公斤，回收率約為 75％以上。 在測(cè)定中黃曲霉毒素高的霉粒，一粒就可以左右測(cè)定結(jié)果，而有毒霉粒在整個(gè)檢品中占比例是小的，而分布又不均勻，為避免采樣帶來(lái)的誤差，取樣量應(yīng)盡量多一些，（ 1000 克）并將取樣充分均合盡多的粉碎，使盡量取得相對(duì)可靠一些的結(jié)果，因而在取樣時(shí)應(yīng)注意： ①根據(jù)規(guī)定檢取有代表性樣品?；蛘吲c單向展開(kāi)法結(jié)合使用，方法同上。 觀察與評(píng)定結(jié)果：在紫外光燈下，觀察一、二板，如第二板出現(xiàn)最低檢出量的 B1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，而第一板與其相同位置未出現(xiàn)熒光點(diǎn)，樣品中黃曲霉毒素 B1含量在 5 微克 /公斤以下，如第一板在與第二板 B1 標(biāo)點(diǎn)相同位置出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則應(yīng)將第一板與第二板比較，看第三板上與第一板相同位置的熒光點(diǎn)，是否與 B1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊，如果重疊，再進(jìn)行確證試驗(yàn)。 （多用于雜質(zhì)干擾嚴(yán)重的樣液） 滴樣：取薄層板三塊，在距下緣 3 厘米的基線上滴加黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)液與樣液。 如果需要作確證試驗(yàn)，于第四、五兩板距邊緣 厘米處各滴加 B1標(biāo)準(zhǔn)液（ 微克 /毫升） 10 微升，再于其上滴加三氟醋酸一小滴，距左邊緣 厘米處，第四板滴加樣液 20 微升，三氟醋酸一小滴，第五板滴加樣液 20 微升，黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（ 微克 /毫升）10 微升，三氟乙醋一小滴，產(chǎn)生衍生物的步驟同單相展開(kāi)法。在紫外燈光下，觀察第一、二板，若第二板的第二點(diǎn)在 B1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)處出現(xiàn)最低檢出量，而第一板在第二板的相同位置上未出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則試樣中黃曲霉毒素 B1含量在 5 微克 /公斤以下。第二步展開(kāi)。 如用單向展開(kāi)法展開(kāi)后，薄層板上由于雜質(zhì)的干擾，掩蓋了黃曲霉毒素 B1的熒光強(qiáng)度時(shí)，需采用雙向展開(kāi)法。 第四點(diǎn)：黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)溶液（ 微克 /毫升）10 微升。 為了證實(shí)薄層板上樣液熒光系由黃曲霉毒素 B1 產(chǎn)生的，滴加三氟乙酸產(chǎn)生黃曲霉毒素 B1 的衍生物，展開(kāi)后，這種衍生物的比移值，約在 左右。 第三點(diǎn)：樣液 20 微升加黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)液（ 微克 /毫升） 10 微升。在空氣中干燥 15 分鐘后，放入烘箱內(nèi)100℃活化 2 小時(shí)取出放入干燥器內(nèi)保存，一般在干燥器內(nèi)可保存 2－ 3 天，若放置時(shí)間較長(zhǎng)，則應(yīng)重新活化。振搖 2 分靜止分層。 ④適用于醬類（包括豆乳制品） 稱取樣品 20 克于 250 毫升具塞三角燒瓶中，加正已烷 20 毫升與甲醇水 50 毫升，振蕩 30 分鐘，靜止片刻，以脫脂棉過(guò)濾 ，濾液靜止分層后，取甲醇水 24 毫升于分液漏斗中加入氯仿 20 毫升振蕩 2 分靜止分層下以按①操作，最后加入苯乙腈 2 毫升，每毫升相當(dāng)于樣品 4 克。 稱取樣品 4 克于小燒杯中，用正已烷 20 毫升轉(zhuǎn)移于 125 毫升分液漏斗中，再用甲醇水（ 55+45） 20 毫升分?jǐn)?shù)次洗滌小燒杯，洗