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【正文】 百分含量 （ %） 標(biāo)準(zhǔn) 偏差 a b 平均值 c d RSD（％） e 表 22 為金絲桃素重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果， RSD 值為 %，說明該方法的重復(fù)性良好。 穩(wěn)定性試驗(yàn) 表 23 金絲桃素穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 The result of stability test 時(shí)間 （ h） 峰面積 測(cè)得 量 （ μg） 標(biāo)準(zhǔn)偏差 0 平均值 5 RSD（％） 10 表 23 為金絲桃素穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果表明在 10 小時(shí)內(nèi)， RSD 值為 %，該方法在10 小時(shí)內(nèi)該方法穩(wěn)定性良好。 加樣回收試驗(yàn) 表 24 金絲桃素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 The result of recovery test 樣品 樣品 含量（ μg） 加入量（ μg） 實(shí)測(cè)值 （ μg） 回收率 (%) 標(biāo)準(zhǔn)偏差 a b 平 均值 c d RSD（ ％ ） e 表 24 金絲桃素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果， 表明該提取和檢測(cè)方法精密度良好。 偽金絲桃素 HPLC 定量的方法學(xué)研究 線性關(guān)系考察 得到偽金絲桃素標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖 28： 偽金絲桃素標(biāo)準(zhǔn)曲線 y = 1475x + R2 = 1050010001500202125000 1 偽金絲桃素質(zhì)量(ug )峰面積 圖 28 偽金絲桃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線 The calibration curve of Pseudohypericin 圖 29 為 偽 金絲桃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，可以得到 偽 金絲桃素的線性回歸方程： Y=1475x+， R2=1。 偽金絲桃素進(jìn)樣量在 。 精密度試驗(yàn) 表 25 偽金絲桃素精密度試驗(yàn)結(jié)果 The result of precision test 次數(shù) 峰面積 測(cè)得 量 （ μg） 標(biāo)準(zhǔn)偏差 1 2 平均值 3 4 5 6 RSD（％） 7 表 25 為偽金絲桃素精密度試驗(yàn)結(jié)果， RSD 為 %，說明該方法精密度良好。 重復(fù)性試驗(yàn) 表 26 偽金絲桃素重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 The result of reproducibility test 樣品 編號(hào) 樣品量 （ mg） 峰面積 測(cè)得 量 （ μg） 偽金絲桃素 百分含量 (%) 標(biāo)準(zhǔn) 偏差 a b 平均值 c d RSD（％） e 表 26 為偽金絲桃素重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果， RSD 值為 %，說明該方法的重復(fù)性良好。 穩(wěn)定性試驗(yàn) 表 27 偽金絲桃素穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 The result of stability test 時(shí)間 峰面積 測(cè)得 量 （ μg） 標(biāo)準(zhǔn)偏差 0 h 平均值 RSD（％） 10h 表 27 為 偽金絲桃素穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果，在 10 小時(shí)內(nèi)， RSD 值為 %，說明在 10 小時(shí)內(nèi)該方法穩(wěn)定性良好。 加樣回收試驗(yàn) 表 28 偽金絲桃 素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 The result of recovery test 樣品 樣品含量（ μg） 加入量（ μg） 實(shí)測(cè)值 （ μg） 回收率 (%) 標(biāo)準(zhǔn) 偏差 a b 平均值 c d RSD（ %） e 表 28 為偽金絲桃素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果，表明該提取和檢測(cè)方法精密度良好。 貫葉連翹浸膏的定量分析 所測(cè)得結(jié)果取平均值，市售貫葉連翹浸膏（寧波神馬公司）中金絲桃素含量為 ％，偽金絲桃素含量為 ％。 本章小結(jié) （ 1） 本章采用薄層層析法建立了金絲桃素和偽金絲桃素的定性檢測(cè)方法。以硅膠 GF254高效預(yù)制板為固定相，氯仿 :甲醇＝ :；石油醚 :乙酸乙酯 :甲醇 =5:20:2；二氯甲烷 :甲醇 =9:1為流動(dòng)相進(jìn)行展開，在紫外 366nm 下進(jìn)行觀察，結(jié)果金 絲桃素和偽金絲桃素顯出明顯的紅色熒光，無其他物質(zhì)干擾，效果良好。 （ 2） 采用 HPLC 法對(duì)金絲桃素和偽金絲桃素進(jìn)行定量檢測(cè)。流動(dòng)相為 甲醇 Na2HPO4（ H3PO4調(diào) ） =7:1，檢測(cè)波長(zhǎng)為 590nm，柱溫為 30℃ ，流速為 ，結(jié)果圖譜中金絲桃素和偽金絲桃素峰形尖銳，無拖尾現(xiàn)象，分離效果良好，保留分別為 和 。對(duì)該方法進(jìn)行的方法學(xué)研究表明，金絲桃素和偽金絲桃素的線性范圍分別為 ，精密度、重 復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收結(jié)果良好。 第三章 金絲桃素和偽金絲桃素提取方法的研究 實(shí)驗(yàn)器材 主要試劑及原料 氯仿，分析純， 廣東東紅化工 廠 甲醇，分析純，廣東臺(tái)山粵僑試劑塑料有限公司 甲醇，色譜純，天津協(xié)和 醫(yī)學(xué) 科技有限公司 冰醋酸，分析純，廣州東紅化工廠 磷酸，分析純，廣州市番禺力強(qiáng)化工廠 Na2HPO4 12H2O，廣州化學(xué)試劑廠 金絲桃素標(biāo)準(zhǔn)品， 瑞士 Alexis Biochemicals 公司 偽金絲桃素標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó) ChromaDex公司 貫葉連翹 浸膏 ， 寧波神馬公司 貫葉連翹原藥材，成都市售 儀器及設(shè)備 臺(tái)式高速離心機(jī) ： Eppendorf Centrifuge 5415D 高效液相色譜儀： Agilent 1100 Series（四元泵，在線真空脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測(cè)器， 色譜工作站） 超聲 波清洗器 ： KQ320DE，昆山市超聲儀器有限公司 pH 計(jì)： Mettler Toledo 320 PH meter 超純水儀： LABCONCO Water Pro PS 電熱恒溫鼓風(fēng) 干燥箱： DHG905SA上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司 PTFE 濾膜： SRP 15 μm 實(shí)驗(yàn)方法 超聲提取法工藝參數(shù)的確定 針對(duì)金絲桃素的特點(diǎn)，主要從溶劑的種類、溶劑濃度、冷浸時(shí)間、超聲提取時(shí)間、超聲提取液固比、超聲提取次數(shù) ，超聲功率 幾個(gè)方面來考察對(duì)提取物中金絲桃素純度的影響。以下試驗(yàn)每個(gè)做三次，計(jì)算平均值。 溶劑種類的選擇 精密稱取 1g貫葉連翹粉末 7份于 50ml容量瓶中，分別加入甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、甲苯、石油醚定容，避光放置半個(gè)小時(shí)后，超聲提取 30min，超聲功率 100W。補(bǔ)加溶劑至原體積，采用高效液相色譜法檢測(cè)金絲桃素的含量，計(jì)算提取 物中金絲桃素純度。 溶劑濃度的選擇 精密稱取 1g貫葉連翹粉末 7份于 50ml容量瓶中，分別加入 100%、 90%、 80%、 70%、 60%、50％、 40％的乙醇定容，避光放置半個(gè)小時(shí)后，超聲提取 30min，超聲功率 100W。補(bǔ)加溶劑至原體積，采用高效液相色譜法檢測(cè)金絲桃素的含量，計(jì)算提取物中金絲桃素純度。 冷浸時(shí)間的影響 精密稱取 1g貫葉連翹粉末 5份于 50ml容量瓶中，加入 60％乙醇定容，分別避光放置 0h、2h、 4h、 6h、 8h 后，超聲提取 30min，超聲功率 100W。補(bǔ)加溶劑至原 體積，采用高效液相色譜法檢測(cè)金絲桃素的含量，計(jì)算提取物中金絲桃素純度。 超聲提取時(shí)間的影響 精密稱取 1g貫葉連翹粉末 6份于 50ml容量瓶中，加入 60％乙醇定容，分別超聲提取 0min、30min、 60min、 90min、 120min、 150min，超聲功率 100W。補(bǔ)加溶劑至原體積，采用高效液相色譜法檢測(cè)金絲桃素的含量，計(jì)算提取物中金絲桃素純度。 超聲提取液固比的影響 精密稱取 5g、 、 1g、 、 貫葉連翹粉末于 50ml 容量瓶中，加入純 60％乙醇定容（液固比 分別為 10: 20: 50: 100: 200:1），超聲提取 90min，超聲功率 100W。補(bǔ)加溶劑至原體積，采用高效液相色譜法檢測(cè)金絲桃素的含量，計(jì)算提取物中金絲桃素純度。 超聲提取次數(shù)的影響 精密稱取 1g貫葉連翹粉末五份于 50ml容量瓶中，加入純乙醇定容，分別提取 5 次，每次均超聲 90min，超聲功率 100W。合并各次提取液，補(bǔ)加溶劑至原體積，采用高效液相色譜法檢測(cè)金絲桃素的含量，計(jì)算提取物中金絲桃素純度。 超聲功率的影響 精密稱取 1g貫葉連翹粉末五 份于 50ml容量瓶中，加入純乙醇定容，分別在 20W、 40W、60W、 80W、 100W 的功率下超聲 90min。合并各次提取液，補(bǔ)加溶劑至原體積，采用高效液相色譜法檢測(cè)金絲桃素的含量，計(jì)算提取物中金絲桃素純度。 結(jié)果與討論 溶劑種類的選擇 金絲桃素含量（％）甲醇 乙醇 丙酮 乙酸已酯 氯仿 甲苯 石油醚 圖 31 溶劑種類的選擇 The determination of solvent 從 圖 31 看，甲醇、乙醇、丙酮對(duì)金絲桃素的提取效果最好，從成本和毒性考慮，工業(yè)中不宜大量使用甲醇、丙酮，因此采用乙醇為溶劑。 溶劑 濃度的選擇 100 90 80 70 60 50 40乙醇溶度（％）金絲桃素含量（％） 圖 32 乙醇濃度的選擇 The determination of solvent concentration 從 圖 32 看， 60％、 70％、 80%的乙醇提取金絲桃素的含量相對(duì)較高，三者相差不大，根據(jù)成本高低選擇采用純 60％乙醇為溶劑。 冷浸時(shí)間的影響 2 4 6 8 10冷浸時(shí)間（h）金絲桃素含量（％） 圖 33 冷浸時(shí)間的選擇 The determination of soak time 從 圖 33 看，冷浸時(shí)間對(duì)金絲桃素的提取并沒有較顯著的影響，因此不進(jìn)行冷浸。 超聲提取時(shí) 間的影響 0 30 60 90 120 150超聲時(shí)間（Min ）金絲桃素含量（％） 圖 34 超聲時(shí)間的選擇 The determination of ultrasonic time 從結(jié)果看，隨著超聲時(shí)間的增加，提取液中金絲桃素的含量隨之增加，當(dāng)?shù)?90 分鐘后出現(xiàn)一個(gè)穩(wěn)定期， 120 分鐘后反而有些下降，這可能是金絲桃素的對(duì)光和熱不穩(wěn)定的緣故。 超聲提取液固比的影響 10 20 50 100 200液固比（mL/ g）金絲桃素含量（％） 圖 35 液固比的選擇 The determination of liquid to solid ratio 從結(jié)果看，隨著液固比的增加，提取液中所含的金絲桃素隨之 增加，但當(dāng)液固比大于 50:1 后，增加的量很少，因此從節(jié)約角度考慮，選擇 50:1 為最佳。 超聲提取次數(shù)的影響 1 2 3 4 5超聲次數(shù)金絲桃素含量（％） 圖 36 提取次數(shù)的選擇 The determination of distill times 從結(jié)果看，一次提取后金絲桃素基本被完全提取出來，因此只需提取一次即可。 超聲功率的影響 20 40 60 80 100超聲功率（W)金絲桃素含量（％） 圖 37 提取功率的選擇 determination of distill power 從結(jié)果看，功率越高，提取效果更好，但已經(jīng)是調(diào)到超聲清洗 儀的最高功率。所以要更好 的效果，需要購買功率更大的超聲提取儀。在這里選擇 100W。 金絲桃素提取正交試驗(yàn) 浸膏的超聲提取 根據(jù)文獻(xiàn)，影響金絲桃素提取率的因素主要有：溶劑濃度，溶劑用量，提取時(shí)間，提取溫度?？紤]到我們采用超聲提取，因此省去提取溫度這一因素。因素水平和正交表分別見下表 31和表 32： 根據(jù) 表 32 正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)： ① 稱取浸膏 50ml容量瓶中，分別用 40％、 60％、 80％乙醇定容，然后分別在超聲清洗儀中超聲 60、 1 90min。 ② 稱取浸膏 1g 三份于 50ml 容量瓶中。分別用 40％、 60％、 80％乙醇定容，然后分別在超聲清洗儀中超聲 90、 60、 120min。 ③ 稱取浸膏 50ml容量瓶中。分別用 40％、 60％、 80％乙醇定容，然后分別在超聲清洗儀中超聲 1 90、 60min。 ④ 上述 9 個(gè)樣品超聲后，分別吸取上層清液，過 膜， HPLC 檢測(cè)。 表 31 因素和水平 表 31 factor and level 水平 因素 液固比 (ml/g) A 乙醇濃度 (%) B 提取時(shí)間 (min) C 1 20 40 60 2 50 60 90 3 100 80 120 表 32 正交表 (L33) Tab. 32 Orthogonal tab