【正文】 形顆粒，具有三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這樣混合物就按分子量由大到小先后流出并得到分離。與 Sephadex G 比較，Sephadex LH20分子中羥基總數(shù)不變，但碳原子的數(shù)目相對(duì)增加了，因此親脂性增強(qiáng)，不僅可以在水中使用，也可以在極性有機(jī)溶劑或含水的混合溶劑中使用。適于不同類(lèi)型化合物的分離，在天然產(chǎn)物分離純化方面得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。 制備型高效液相色譜 制備型 HPLC 是在傳統(tǒng)的分析型 HPLC 的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種高效分離純化技術(shù)，但制備色譜不是分析色譜的簡(jiǎn)單放大，它與分析色譜有許多不同之處。 制備高效液相色譜根據(jù)待分離樣品的負(fù)載量可分為兩類(lèi)，一類(lèi)為研究開(kāi)發(fā)型，另 一類(lèi)為工業(yè)生產(chǎn)型。這類(lèi)色譜中經(jīng)濟(jì)效益并不是首 要考慮的因素，對(duì)儀器裝置要求不高，任何達(dá)到預(yù)期分離目標(biāo)的儀器均可使用。這兩類(lèi)制備色譜的在其柱設(shè)計(jì)上也有很大不同，實(shí)驗(yàn)規(guī)模制備分離所用色譜柱的設(shè)計(jì)、填充及操作與常用分析柱基本相同，其內(nèi)徑一般為 10~50mm，但大規(guī)模生產(chǎn)所用制備柱的內(nèi)徑通常大于 50mm，為了得到高效柱，其柱型及結(jié)構(gòu)與前者不同，對(duì)填料及其填充技術(shù)要求也更高。在 抗抑郁方面 ，由貫葉連翹單味藥組成的植物藥如 Jarsin 等已上市銷(xiāo)售，并已成為治療中 、 輕度抑郁癥的主導(dǎo)藥物 ；同時(shí) 目前國(guó)內(nèi)外已完成了金絲桃素抗愛(ài)滋病的 Ⅱ 期臨床試驗(yàn)，治療惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床研究也在進(jìn)行之中。該植物提取物已被 FDA批準(zhǔn)為食品添加劑，并收入德國(guó) 、 英國(guó) 、 法國(guó)等國(guó)藥典。 貫葉連翹在我國(guó)作為一種中藥材品種， 已 載入 最新 2021 版藥典中 。貫葉連翹提取物及其制劑的研究，不但涉及重大疾病的治療，而且還與現(xiàn)代重大社會(huì)問(wèn)題有關(guān)，在我國(guó)具有巨大的現(xiàn)實(shí)市場(chǎng)和潛在市場(chǎng)。 國(guó)外對(duì) 貫葉連翹 原植物栽培 、 化學(xué)成分 、 藥理和臨床進(jìn)行了大量的研究，但對(duì)其制備工藝的研究并不多 。本論文 嘗試 建立一種簡(jiǎn)單有效的方法對(duì)貫葉連翹中的金絲桃素進(jìn)行連續(xù)提取分離，獲得高含量的金絲桃素提取物。 第二章 金絲桃素和偽金絲桃素檢測(cè)方法的研究 實(shí)驗(yàn)器材 主要試劑及原料 甲醇，分析純，廣東臺(tái)山粵僑試劑塑料有限公司 甲醇，色譜純，天津協(xié)和 醫(yī)學(xué) 科技有限公司 氯仿，分析純， 廣東東紅化工 廠 二氯甲烷，分析純，廣州化學(xué)試劑二廠 石油醚， 60℃ ~90℃，分析純，廣州化學(xué)試劑二廠 乙酸乙酯，分析純，廣東光華化學(xué)廠 甲酸，分析純， 廣東臺(tái)山粵僑試劑塑料有限公司 三乙胺，分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠 磷酸，分析純， 廣 州市番禺力強(qiáng)化工廠 Na2HPO4稱(chēng)取 40g GF254 薄層硅膠于研磨中，加入 120ml 羧甲基纖維素鈉溶液，朝一個(gè)方向不斷研磨。 取 風(fēng)干 好的 硅膠預(yù)制板放入電熱干燥箱， 105℃ 活化30min，取出放于干燥器中備用。 精密稱(chēng)取偽金絲桃素標(biāo)準(zhǔn)品 ，置 1ml容量瓶中，以色譜純甲醇溶解，超聲 30min，冷卻 后定容 ， 避光保存，為儲(chǔ)備液 ，濃度為 。 薄層層析 用毛細(xì)管進(jìn)行點(diǎn)樣，在層析缸中展開(kāi)， 展開(kāi)后取出，揮干溶劑，在 366nm下直接觀察 ，并拍照 。 精密吸取上述偽金絲桃素儲(chǔ)備液 200μl，定容到 1ml 棕色容量瓶中，濃度為 。 12H2O 于 500 ml燒杯中，加 495 ml超純水溶解，以磷酸水溶液調(diào) pH 至 ， 于 500 ml容量瓶中定容，過(guò) μm濾膜。 精密度試驗(yàn) 以濃度為 ，連續(xù)進(jìn)樣 5次，進(jìn)樣量為 15μl，測(cè)定峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。分別進(jìn)樣 5μl，測(cè)定峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。以實(shí)測(cè)加入的純品量除以理論加入的純品量，計(jì)算回收率。 精密度試驗(yàn) 以濃度為 ，連續(xù)進(jìn)樣 5 次，進(jìn)樣量為 5μl，測(cè)定峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。分別進(jìn)樣 5μl，測(cè)定峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。以實(shí)測(cè)加入的純品量除以理論加入的純品量，計(jì)算回收率。 結(jié)果與討論 金絲桃素及偽金絲桃素的定性分析 展開(kāi)劑的選擇 實(shí)驗(yàn)中嘗試采用幾種較常用的展開(kāi)劑組合，如氯仿 甲醇體系，石油醚 乙酸乙酯體系、石油醚 丙酮體系 、正丁醇 丙酮體系、氯仿 乙醇，二氯甲烷 甲醇，石油醚 乙酸乙酯 甲醇 體系 ，分別采用不同的比例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)， 結(jié)果氯仿 甲醇 ，石油醚 乙酸乙酯 甲醇，二氯甲烷 甲醇體系 能夠有效的分離金絲桃素和偽金絲桃素。另外， 在 展開(kāi)劑中加入冰醋酸， 可以有效的抑制拖尾現(xiàn)象， 有助于改善展開(kāi)效果。 金絲桃素及偽金絲桃素的定量分析 色譜條件的確定 （ 1） 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 取上述配置的金絲桃素和偽金絲桃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其在全波長(zhǎng)下的吸收值。 a b c 圖 21 不同展開(kāi)劑 的 薄層層析比較 （ a:氯仿 :甲 醇 =:； b:石油醚 :乙酸乙酯 :甲醇 =5:20:2； c:二氯甲烷 :甲醇 =9:1），每個(gè)圖 從左至右依次為金絲桃素、樣品、偽金絲桃素。b: petroleum benzene: acetic ether: methanol:=5:20:2。 （ 2） 流動(dòng)相的確定 通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以 不同比例的 甲醇 水作為流動(dòng)相時(shí)，未能檢測(cè)到金絲桃素和偽金絲桃素的色譜峰，只有在水相中加入了一定比例的 Na2HPO4 溶液 后，色譜圖上才能清晰地得到金絲桃素和偽金絲桃素的色譜峰。 （ 3） 流動(dòng)相流速的確定 在 高效 液相 色譜 中，流動(dòng)相的流速增大，塔板高度增大，柱效降低，因此一般都采用低流速，但流速過(guò)低 時(shí)，組分在流動(dòng)相中的停留時(shí)間增大，引起擴(kuò)散，而使峰形變寬， 經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比， 采用 ， 色譜峰峰型和保留時(shí)間較為理想 。 金絲桃素和偽金絲桃素的色譜圖 根據(jù)以上確定的色譜條件，色譜柱采用依利特 Kromasil C18（ 200mm， 5μm）；柱溫： 30℃ ；流動(dòng)相：甲醇 （ H3PO4調(diào) ） =7:1；流速： ；檢測(cè)波長(zhǎng)： 590nm；進(jìn)樣量：供試品溶液與 標(biāo)準(zhǔn) 品溶液均為 10μl。由圖 27 得到金絲桃素的線性回歸方程：Y=+ R2=。 金絲桃素標(biāo)準(zhǔn)曲線y = + R2 = 01002003004005006007008000 1 2 質(zhì)量(ug )峰面積 圖 27 金絲桃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線 The calibration curve of hypericin 偽金絲桃素 金絲桃素 精密度試驗(yàn) 表 21 金絲桃素精密度試驗(yàn)結(jié)果 The result of precision test 次數(shù) 峰面積 測(cè)得 量 （ μg） 標(biāo)準(zhǔn)偏差 1 2 平均值 3 4 RSD（ %） 5 表 21 為金絲桃素精密度試驗(yàn)結(jié)果， RSD 為 %，說(shuō)明該方法精密度良好。 穩(wěn)定性試驗(yàn) 表 23 金絲桃素穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 The result of stability test 時(shí)間 （ h） 峰面積 測(cè)得 量 （ μg） 標(biāo)準(zhǔn)偏差 0 平均值 5 RSD（％） 10 表 23 為金絲桃素穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果表明在 10 小時(shí)內(nèi)， RSD 值為 %，該方法在10 小時(shí)內(nèi)該方法穩(wěn)定性良好。 偽金絲桃素 HPLC 定量的方法學(xué)研究 線性關(guān)系考察 得到偽金絲桃素標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖 28： 偽金絲桃素標(biāo)準(zhǔn)曲線 y = 1475x + R2 = 1050010001500202125000 1 偽金絲桃素質(zhì)量(ug )峰面積 圖 28 偽金絲桃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線 The calibration curve of Pseudohypericin 圖 29 為 偽 金絲桃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，可以得到 偽 金絲桃素的線性回歸方程： Y=1475x+， R2=1。 精密度試驗(yàn) 表 25 偽金絲桃素精密度試驗(yàn)結(jié)果 The result of precision test 次數(shù) 峰面積 測(cè)得 量 （ μg） 標(biāo)準(zhǔn)偏差 1 2 平均值 3 4 5 6 RSD（％） 7 表 25 為偽金絲桃素精密度試驗(yàn)結(jié)果， RSD 為 %，說(shuō)明該方法精密度良好。 穩(wěn)定性試驗(yàn) 表 27 偽金絲桃素穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 The result of stability test 時(shí)間 峰面積 測(cè)得 量 （ μg） 標(biāo)準(zhǔn)偏差 0 h 平均值 RSD（％） 10h 表 27 為 偽金絲桃素穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果，在 10 小時(shí)內(nèi)， RSD 值為 %，說(shuō)明在 10 小時(shí)內(nèi)該方法穩(wěn)定性良好。 貫葉連翹浸膏的定量分析 所測(cè)得結(jié)果取平均值，市售貫葉連翹浸膏（寧波神馬公司）中金絲桃素含量為 ％，偽金絲桃素含量為 ％。以硅膠 GF254高效預(yù)制板為固定相，氯仿 :甲醇＝ :；石油醚 :乙酸乙酯 :甲醇 =5:20:2；二氯甲烷 :甲醇 =9:1為流動(dòng)相進(jìn)行展開(kāi)，在紫外 366nm 下進(jìn)行觀察，結(jié)果金 絲桃素和偽金絲桃素顯出明顯的紅色熒光，無(wú)其他物質(zhì)干擾，效果良好。流動(dòng)相為 甲醇 Na2HPO4（ H3PO4調(diào) ） =7:1，檢測(cè)波長(zhǎng)為 590nm，柱溫為 30℃ ，流速為 ，結(jié)果圖譜中金絲桃素和偽金絲桃素峰形尖銳，無(wú)拖尾現(xiàn)象，分離效果良好，保留分別為 和 。 第三章 金絲桃素和偽金絲桃素提取方法的研究 實(shí)驗(yàn)器材 主要試劑及原料 氯仿，分析純， 廣東東紅化工 廠 甲醇，分析純，廣東臺(tái)山粵僑試劑塑料有限公司 甲醇，色譜純，天津協(xié)和 醫(yī)學(xué) 科技有限公司 冰醋酸，分析純，廣州東紅化工廠 磷酸，分析純，廣州市番禺力強(qiáng)化工廠 Na2HPO4以下試驗(yàn)每個(gè)做三次，計(jì)算平均值。補(bǔ)加溶劑至原體積，采用高效液相色譜法檢測(cè)金絲桃素的含量，計(jì)算提取 物中金絲桃素純度。補(bǔ)加溶劑至原體積，采用高效液相色譜法檢測(cè)金絲桃素的含量，計(jì)算提取物中金絲桃素純度。補(bǔ)加溶劑至原 體積，采用高效液相色譜法檢測(cè)金絲桃素的含量，計(jì)算提取物中金絲桃素純度。補(bǔ)加溶劑至原體積，采用高效液相色譜法檢測(cè)金絲桃素的含量，計(jì)算提取物中金絲桃素純度。補(bǔ)加溶劑至原體積，采用高效液相色譜法檢測(cè)金絲桃素的含量，計(jì)算提取物中金絲桃素純度。合并各次提取液，補(bǔ)加溶劑至原體積，采用高效液相色譜法檢測(cè)金絲桃素的含量，計(jì)算提取物中金絲桃素純度。合并各次提取液，補(bǔ)加溶劑至原體積，采用高效液相色譜法檢測(cè)金絲桃素的含量，計(jì)算提取物中金絲桃素純度。 溶劑 濃度的選擇 100 90 80 70 60 50 40乙醇溶度（％）金絲桃素含量（％） 圖 32 乙醇濃度的選擇 The determination of solvent concentration 從 圖 32 看， 60％、 70％、 80%的乙醇提取金絲桃素的含量相對(duì)較高，三者相差不大，根據(jù)成本高低選擇采用純 60％乙醇為溶劑。 超聲提取時(shí) 間的影響 0 30 60 90 120 150超聲時(shí)間（Min ）金絲桃素含量（％） 圖 34 超聲時(shí)間的選擇 The determination of ultrasonic time 從結(jié)果看，隨著超聲時(shí)間的增加，提取液中金絲桃素的含量隨之增加，當(dāng)?shù)?90 分鐘后出現(xiàn)一個(gè)穩(wěn)定期， 120 分鐘后反而有些下降，這可能是金絲桃素的對(duì)光和熱不穩(wěn)定的緣故。 超聲提取次數(shù)的影響 1 2 3 4 5超聲次數(shù)金絲桃素含量（％） 圖 36 提取次數(shù)的選擇 The determination of distill times 從結(jié)果看，一次提取后金絲桃素基本被完全提取出來(lái)，因此只需提取一次即可。所以要更好 的效果，需要購(gòu)買(mǎi)功率更大的超聲提取儀。 金絲桃素提取正交試驗(yàn) 浸膏的超聲提取 根據(jù)文獻(xiàn)，影響金絲桃素提取率的因素主要有：溶劑濃度，溶劑用量，提取時(shí)間，提取溫度。因素水平和正交表分別見(jiàn)下表 31和表 32： 根據(jù) 表 32 正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)： ① 稱(chēng)取浸膏 50ml容量瓶中，分別用 40％、 60％、 80％乙醇定容，然后分別在超聲清洗儀中超聲 60、 1 90min。分別用 40％、 60％、 80％乙醇定容，然后分別在超聲清洗儀中超聲 90、 60、 120min。分別用 40％、 60％、 80％乙醇定容，然后分別在超聲清洗儀中超聲 1 90、 60min。 表 31 因素和水平 表 31 factor and level 水平 因素 液固比 (ml/g) A 乙醇濃度 (%) B 提取時(shí)間 (min) C 1 20 40 60 2 50 60 90 3 100 80 120 表 32 正交表 (L33) Tab. 32 Orthogonal tab